【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学，具体涉及一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法。
技术介绍
1、矽肺是一种由于长期暴露于大量可吸入的游离二氧化硅粉尘颗粒(＜5-10μm)引起的肺部疾病，其基本病理改变是以胶原纤维组织为主的矽肺结节和广泛肺纤维化。其发病机制仍未明确，疾病进展过程中的机制也尚未阐明。
2、然而由于受传统观念的影响，大多数的患者并未意识到自己已经患有严重的疾病，部分患者对于治疗也并不积极，从而错过了最佳的治疗时机，给家庭和社会带来了沉重的负担。因此，如何提高早期硅肺诊断率，降低患者的死亡率和致残率是我国目前迫切需要解决的问题。虽然目前的临床检测手段能够实现对于肺间质和病变组织的病理学检查，但均不能直接反映人体肺部组织受到损伤的程度以及其功能变化情况；其次，尽管有多种药物用于抗硅肺，但是这些药物大多作用较慢，而且存在一定的副作用；再者，目前的研究多以动物作为模型来验证新型药物的有效性，但实验结果往往与实际应用效果之间存在着较大的偏差。
3、目前大多数研究认为当游离sio2颗粒进入肺泡后会引发下呼吸道炎性细胞浸润，成纤维细胞异常增殖，肺泡上皮细胞表达释放多种细胞因子，促进成纤维细胞增生和胶原沉积，可以转分化为成纤维细胞，并在细胞因子刺激下向肌成纤维细胞转化，导致肺部纤维化病变。肺泡ii型上皮细胞作为肺泡主要结构细胞，其具有调节表皮活性物质代谢、肺泡环境的维持、肺损伤时向i型上皮的转化的功能，广泛参与肺部的炎症反应、免疫反应、细胞外基质调节和损伤修复等多种生物学活动。在sio2颗粒的攻击下，肺泡ii型
4、肺泡ⅱ型上皮细胞是分布于肺泡中的一种重要细胞，其主要功能是分泌肺表面活性物质(pulmonary surfactant，ps)，在维持肺泡功能和调节肺的血-气交换等方面具有重要生理功能。肺表面活性物质分布于肺泡上皮细胞的表面，是由肺泡的ⅱ型上皮细胞分泌的脂质和表面活性蛋白组成的复合物，其中约90％为磷脂，约10％为表面活性蛋白。表面活性蛋白包括a、b、c、d四种类型，其中sp-c是高度特异于肺泡ii型上皮细胞的蛋白质，是鉴定肺泡ⅱ型上皮细胞的重要标志。肺表面活性物质具有降低肺泡表面张力,维持肺泡大小，提高肺泡顺应性，防止肺不张和肺水肿等重要生理功能，对维持肺的正常生理功能起到至关重要的作用。
5、目前应用于矽肺的肺泡上皮细胞模型，多选用a549细胞系。a549细胞系是一种广泛使用的人肺腺癌细胞系，虽然其具有部分肺泡上皮特征，但是来源于原发性肺肿瘤，并不能完全模拟正常肺部微环境遭受游离sio2颗粒的即刻反应及后续效应。而从动物或者人体分离出来的原代细胞，标本获取困难且不容易在体外大量扩增，不利于实验的重复验证。目前已有利用永生化技术制备的永生化人肺泡ii型上皮细胞，但是尚缺乏应用该细胞制备矽肺细胞模型的研究数据。
技术实现思路
1、为此，本专利技术提供一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法，尤其是提供一种利用游离sio2颗粒诱导永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的建立方法，通过成功建立的体外矽肺模型，对于研究矽肺疾病的发生发展机制具有重要意义，为后续进一步研究细胞间相互作用及开发相关抗损伤药物提供技术基础及理论参考。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、根据本专利技术提供的一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法，所述方法包括：
4、步骤一，矽尘处理
5、二氧化硅结晶标准品研磨后，利用无血清dmem培养基配置成母液，取母液及不含血清的dmem培养基配置sio2颗粒悬液；
6、步骤二，细胞处理
7、永生化人肺泡ii型上皮细胞原代培养后，进行传代培养，传代培养使用胰酶进行消化，待细胞形态变圆，角消失，加入培养基中止消化后进行后续培养至对数期中的细胞，离心，使用完全培养基制备细胞悬液；调整细胞密度，将细胞接种于培养板内，培养至贴壁后，弃孔内原有培养基，并用1×pbs清洗，随后每孔加入sio2颗粒悬液，进行染毒培养，制备得到生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型。
8、进一步的，所述步骤二中，原代培养使用10％胎牛血清的dmem培养基。
9、进一步的，所述步骤二中，胰酶采用浓度为0.25％。
10、进一步的，所述步骤二中，完全培养基为10％胎牛血清+90％dmem。
11、进一步的，所述步骤二中，调整细胞密度为1×106/ml。
12、进一步的，所述步骤二中，sio2颗粒悬液浓度为75-150μg/ml，优选75或150μg/ml。
13、进一步的，所述步骤二中，染毒培养时间6-12h。
14、进一步的，所述方法还包括将染毒培养后的细胞进行cck-8试剂染色，进行细胞活性检测，孵育3h后观察变色情况。
15、本专利技术具有如下优点：
16、本专利技术以永生化人肺泡ii型上皮细胞为研究对象，利用不同浓度sio2颗粒悬液染毒于永生化人肺泡ii型上皮细胞，通过检测细胞活力确定最优染毒时间和染毒浓度，成功建立了一种体外使用sio2颗粒悬液诱导永生化人肺泡ii型上皮细胞构建矽肺模型的方法。该模型稳定性好，易重复，为后续研究矽肺发生及发展机制和筛选差异分子，开发相关抗损伤药物提供了技术基础和理论参考。
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1.一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，原代培养使用10％胎牛血清的DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，胰酶采用浓度为0.25％。
4.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，完全培养基为10％胎牛血清+90％DMEM。
5.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，调整细胞密度为1×106/mL。
6.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，SiO2颗粒悬液浓度75-150μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡II型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，染毒培养时间6-12h。
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...【技术特征摘要】
1.一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，原代培养使用10％胎牛血清的dmem培养基。
3.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，胰酶采用浓度为0.25％。
4.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡ii型上皮细胞矽肺模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，完全培养基为10％胎牛血清+90％dmem。
5.根据权利要求1所述的一种永生化人肺...
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