【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌检测，更具体地说，它涉及一种柑橘轮斑病菌和炭疽病菌的快速检测方法。
技术介绍
1、炭疽病是影响柑橘生产的主要病害，可为害叶、花、果和枝条，引起果面斑点、枯梢、落花和落果，还可引起采后腐烂。叶片受害表现急性型和慢性型，枝条受害多表现幼嫩新梢枯死，果实受害表现干疤、泪痕和腐烂型。其病原菌属于刺盘孢属(colletotrichum)的两个种，即胶孢炭疽菌(c.gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(c.acutatum)，以及平头炭疽菌(c.truncatum),c.gloeosporioide是优势菌。除培养性状和形态学外，特异性引物cgint/its4和caint/its4可用于区分c.gloeosporioides和c.acutatum。
2、柑橘轮斑病是由pseudofabraea citricarpa造成的一种柑橘真菌性病害，自2004年在陕西城固首次报道，鉴定该病菌为cryptosporiopsis citricarpa zhu，hyde&li(c.citricarpa)，称此病为“轮斑病”(target spot)。后人们将该菌重新鉴定为一个新的单型属pseudofabraea citricarpar。柑橘轮斑病属于低温型病害，在冬末春初发病最重，高温季节一般不发病。其在12月中旬开始出现症状，并逐渐加重，2月下旬至3月中旬为发病高峰，病叶在3月中下旬基本落光。在万州柠檬上，该病也侵染果实，造成果实出现直径0.2cm-2.2cm、黑褐色凹陷斑点，最终落果烂果。
3、
4、因此，现亟需建立区分这两种病原菌种类的快速分子检测体系来快速检测柑橘病害病原菌种类。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的检测方法，能够灵敏、可靠、特异地检测柑橘炭疽病菌和轮斑病菌，且价格低廉，操作简便，不易出现假阳性。
2、本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
3、一种柑橘轮斑病菌和炭疽病菌的快速检测方法，包括以下步骤：
4、s1.样品采集：从田间采集早期发病组织，培养保湿2天，长出少量菌丝后，挑取菌丝作为pcr模板；
5、s2.pcr检测：优化pcr反应体系和参数，进行直接pcr扩增；
6、s3.病菌检测：pcr扩增产物经凝胶电泳分离，利用凝胶成像系统观察扩增条带，根据扩增条带的有无，即可快速区分样品中是否含有轮斑病菌或炭疽病菌。
7、本专利技术还提供了一种柑橘炭疽病菌特异性扩增引物，所述引物用于上述柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的快速鉴定方法中，其核苷酸序列为：cg-f:tacgctctac aaccctttgt ga；co-r：accaagcaga gcttgagggt tg。
8、本专利技术还提供了一种柑橘轮斑病菌特异性扩增引物，所述引物用于上述柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的快速鉴定方法中，其核苷酸序列为：ps-f：catgcccttc ggggtagatc tc；co-r：accaagcaga gcttgagggt tg。
9、优选的，所述pcr反应体系建立包括以下步骤：
10、(1)pcr扩增体系：由2×taq pcr master mix 15ul，0.5μl的上游引物，0.5μl的下游引物，14μl的ddh2o以及菌丝构成；
11、(2)pcr反应条件为：第一步，在95℃下保持3min；第二步，在95℃下保持10s；第三步，在55℃下保持30s；第四步，在72℃下保持20s；第五步，重复第二、三、四步38次；第六步，在72℃下保持5min；第七步，产物维持在4℃。
12、优选的，所述s1中pcr模板包括仅轮斑菌菌丝、仅炭疽菌菌丝、以及轮斑病菌和炭疽菌混合菌丝。
13、综上所述，本专利技术具有以下有益效果：相较于现有技术而言，本专利技术能达到的检测限更低，灵敏度更高，可应用于进行快速检测，整个判断过程不需要病菌分离，克隆和测序，检测时间可以保持在5小时以内，且检测过程中特异性更强，该方法可在柑橘的病害早期能快速区分目前柑橘生产中的2种主要病害(轮斑病和炭疽病)，大大缩短检测鉴定时间，能够很好的解决柑橘轮斑病、炭疽病早期症状极为相似，田间诊断难的问题，避免贻误最佳防治时机，有非常好的经济价值。
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1.一种柑橘轮斑病菌和炭疽病菌的快速检测方法，其特征是：包括以下步骤：
2.一种柑橘炭疽病菌特异性扩增引物，所述引物用于权利要求1所述柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的快速鉴定方法中，其特征是，其核苷酸序列为：Cg-F:TACGCTCTAC AACCCTTTGTGA；Co-R：ACCAAGCAGA GCTTGAGGGT TG。
3.一种柑橘轮斑病菌特异性扩增引物，所述引物用于权利要求1所述柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的快速鉴定方法中，其特征是，其核苷酸序列为：Ps-F：CATGCCCTTC GGGGTAGATCTC；Co-R：ACCAAGCAGA GCTTGAGGGT TG。
4.根据权利要求1所述的一种柑橘轮斑病菌和炭疽病菌的快速检测方法，其特征是：所述PCR反应体系建立包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种柑橘轮斑病菌和炭疽病菌的快速检测方法，其特征是：所述S1中PCR模板包括仅轮斑菌菌丝、仅炭疽菌菌丝、以及轮斑病菌和炭疽菌混合菌丝。
【技术特征摘要】
1.一种柑橘轮斑病菌和炭疽病菌的快速检测方法，其特征是：包括以下步骤：
2.一种柑橘炭疽病菌特异性扩增引物，所述引物用于权利要求1所述柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的快速鉴定方法中，其特征是，其核苷酸序列为：cg-f:tacgctctac aaccctttgtga；co-r：accaagcaga gcttgagggt tg。
3.一种柑橘轮斑病菌特异性扩增引物，所述引物用于权利要求1所述柑橘炭疽病菌和轮斑病菌的快速鉴定方法中...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈泉，何锦辉，羊炼，刘忠贤，
申请(专利权)人：重庆三峡农业科学院重庆市万州区甘宁蚕种场，
类型：发明
国别省市：
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