【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种抗大黄鱼cd8α的单克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
1、硬骨鱼类是一组具有经典适应性免疫系统和原始t细胞的脊椎动物，因此它们被认为是研究t细胞免疫进化的理想模型。与高等哺乳动物相似，硬骨鱼类t细胞介导的细胞毒性在适应性免疫系统中扮演着至关重要的角色，并主要由cd8+t细胞执行，cd8+t细胞能增殖、分化为细胞毒性效应t细胞，具有杀伤能力，其存在对于机体抵御病原体感染尤为重要。由于缺乏能特异性识别cd8+t细胞的单克隆抗体，对cd8+t细胞的了解主要来自哺乳动物模型，而早期脊椎动物中cd8+t细胞的功能及增殖、分化等免疫学相关机制在很大程度上仍不清楚。
2、cd8是cd8+t细胞的表面marker，有两种形式，αα同源二聚体，αβ异源二聚体。因此，相较于cd8β，cd8α是cd8+t细胞的主要tcr共受体，在t细胞介导的细胞毒性中发挥更重要的作用。([1]coledk, gao gf. cd8: adhesion molecule, co-receptor and immuno-modulator. cell mol immunol. 2004 apr;1(2):81-8. [2]moore lj, somamoto t, liekk, dijkstra jm, hordvik i. characterisation of salmon and trout cd8alpha andcd8beta. mol immunol. 2005jun;42(10):1225-34
技术实现思路
1、图1：免疫荧光标记的nih\3t3-lccd8α细胞。
2、图2：流式细胞仪检测抗大黄鱼cd8α单克隆抗体标记的淋巴细胞；
3、图a：同型一抗对照标记的头肾淋巴细胞样品；图b：抗大黄鱼cd8α单克隆抗体标记的头肾淋巴细胞样品。
4、图3：免疫荧光标记大黄鱼淋巴细胞；
5、图中蓝色指示dapi标记的细胞核，绿色指示抗大黄鱼cd8α单克隆抗体特异性标记的cd8+t淋巴细胞。
6、图4：cd8+t细胞和cd8-t细胞的细胞标记物的基因表达谱分析结果。其中，actin是内参基因，cd3是t细胞的标志物，cd4-1和cd4-2是cd4+t细胞的标志物，cd8α和cd8β是cd8+t的细胞标志物，igt是b细胞的标志物；cd8+表示cd8+t细胞，cd8-表示cd8-t细胞。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.抗大黄鱼CD8α单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株CD8α-5E3，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024283，保藏日期为2024年08月26日所分泌。
2.如权利要求1所述抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中制备NIH\3T3-LcCD8α稳转细胞株的方法为：将表达载体pCDH-CMV-GFP-LcCD8α、包装载体psPAX2和包膜载体pMD2.G一同转染293T细胞包装得到LcCD8α慢病毒；所得LcCD8α慢病毒浓缩后感染NIH\3T3细胞，经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达LcCD8α的细胞株NIH\3T3-LcCD8α。
4.根据权利要求3所述抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述转染的体系为15μg表达载体pCDH-CMV-GFP-LcCD8α、6μg包装载体psPAX2和3μg包膜载体pMD2.G加入到750μl无血清DMEM培养基中，同时另取75
5.根据权利要求3所述抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述LcCD8α慢病毒浓缩的步骤为将转染293T细胞包装得到LcCD8α慢病毒上清与病毒浓缩液5*PEG8000以4:1混合,4°C摇床过夜；所述嘌呤霉素浓度为5μg/ml。
6.根据权利要求2所述大黄鱼CD8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，制备杂交瘤细胞株CD8α-5E3的具体方法为：将NIH\3T3-LcCD8α细胞与无血清DMEM培养基混合，作为抗原免疫Balb/C小鼠，以骨髓瘤细胞与产生抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的小鼠脾细胞融合，得分泌抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的杂交瘤细胞株CD8α-5E3。
7.根据权利要求2所述大黄鱼CD8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中制备抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的方法为将杂交瘤细胞株CD8α-5E3使用有限稀释法和流式细胞术两种方法结合，筛选出分泌抗大黄鱼CD8α单克隆抗体的杂交瘤细胞株CD8α-5E3，进而得到单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的抗大黄鱼CD8α单克隆抗体在特异性识别大黄鱼CD8+ T细胞中的应用。
...【技术特征摘要】
1.抗大黄鱼cd8α单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株cd8α-5e3，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2024283，保藏日期为2024年08月26日所分泌。
2.如权利要求1所述抗大黄鱼cd8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述抗大黄鱼cd8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中制备nih\3t3-lccd8α稳转细胞株的方法为：将表达载体pcdh-cmv-gfp-lccd8α、包装载体pspax2和包膜载体pmd2.g一同转染293t细胞包装得到lccd8α慢病毒；所得lccd8α慢病毒浓缩后感染nih\3t3细胞，经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达lccd8α的细胞株nih\3t3-lccd8α。
4.根据权利要求3所述抗大黄鱼cd8α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述转染的体系为15μg表达载体pcdh-cmv-gfp-lccd8α、6μg包装载体pspax2和3μg包膜载体pmd2.g加入到750μl无血清dmem培养基中，同时另取750μl无血清dmem培养基稀释24μl lipo8000脂质...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈新华，赖国龙，吴怡楠子，丁扬，刘思畅，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。