【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种在植物来源的生物体中生产鸢尾素(irisin)，特别是重组鸢尾素的方法。本专利技术还涉及鸢尾素的制剂及其给药途径。
技术介绍
1、鸢尾素是一种在身体锻炼过程中由肌肉产生的分子，是一种在包含纤连蛋白iii型结构域的膜蛋白(fndc5)切割后释放的肌细胞因子。最初，人们描述了其诱导白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞转分化的能力，但后来的研究突强调了鸢尾素对其他组织和器官更广泛的影响。这些影响中有许多具有重要的临床意义：低剂量鸢尾素在肌肉骨骼系统中预防和治疗骨质疏松症及肌肉萎缩的能力；通过降低胰岛素抵抗调节能量代谢的作用；以及在保护记忆和减缓诸如阿尔茨海默病等神经退行性疾病认知衰退的能力。
2、因此，鸢尾素正逐渐成为代谢疾病及其他在身体锻炼后可见改善的疾病的重要分子钥匙。
3、将上述主要在小鼠模型中获得的结果转化至人类能够带来药物的开发，该药物将代表一种高度创新的模拟运动的治疗策略，并在医学领域具有多种应用。然而，进一步的临床前研究步骤，特别是针对监管临床前驱症状到人类临床试验，涉及大动物模型中的实验研究，因此需要大量的蛋白质，而这些蛋白质必须按照良好生产规范(“gmp”)进行生产。
4、这样的开发首先需要大规模、经济高效地生产对患者尽可能安全的分子。
5、重组dna技术使得在大肠杆菌和中国仓鼠卵巢细胞(“cho”细胞)中生产鸢尾素成为可能。然而，在这些系统中表达重组蛋白存在许多缺点，包括产量低、大规模应用时方案复杂、可能存在免疫原性内毒素以及成本极高。这些缺点，加上高昂的成本
6、因此，有必要提供一种能够简单、快速和低成本获得大量鸢尾素的生产鸢尾素的方法。
7、除了与鸢尾素生产相关的技术问题外，还有许多与鸢尾素给药相关的问题。例如，以其天然形式，鸢尾素可能无法口服给药，因为存在于胃肠道的各个部分中的蛋白酶会在胃和/或肠道水平将其消化，这对可能接受慢性鸢尾素治疗的患者的依从性构成了限制。
8、专利技术目的
9、因此，本专利技术的目的是提供一种能够简单且快速获得大量鸢尾素的生产鸢尾素的方法。
10、本专利技术的进一步目的是提供一种生产鸢尾素的方法，该方法具有高产量和低成本。
11、本专利技术的另一个目标是提供一种鸢尾素的制剂，该制剂能够改善该分子的药效学和药代动力学特性，并提高患者在人体试验中的依从性。
12、本专利技术的另一个目标是提供一种可以安全、方便且快速给药的鸢尾素制剂。
13、本专利技术的另一个目标是提供一种能够实现高水平表达鸢尾素的合成基因。
技术实现思路
1、上述目的以及其他目的通过本专利技术的内容得以实现，即一种生产鸢尾素的方法，特别是生产重组鸢尾素的方法，其包括以下步骤：
2、a)提供至少一种表达载体，优选至少一种质粒，包含编码鸢尾素的核苷酸序列；
3、b)将该表达载体插入至少一种农杆菌(agrobacterium)属的细菌中，从而获得包含该表达载体的农杆菌属的细菌；
4、c)用所述包含表达载体的细菌处理至少一种植物材料，从而获得经处理的植物材料；
5、d)培育所述经处理的植物材料，使其表达所述鸢尾素；
6、e)从所述植物材料中提取所述鸢尾素。
7、事实上，已观察到植物来源的生物体能够表达鸢尾素，特别是重组鸢尾素，例如以非糖基化或轻度糖基化的形式，但其产量显著高于已知技术所能达到的水平。
8、此外，植物具有多项优势，使其在生产重组蛋白，特别是用于药理目的时，具有吸引力。例如，它们可以在小型温室中大规模轻松种植，并且不含免疫原性细菌内毒素，而这在大肠杆菌生产的蛋白质纯化过程中是一个主要难点。
9、此外，与传统表达系统(如微生物发酵和哺乳动物细胞培养)相比，植物生产系统成本低廉，易于在工业规模上实施，并且发现其不含对人类健康有害的病原体。
10、在此，术语"重组鸢尾素"指的是通过转录和翻译插入宿主生物体中的重组dna片段获得的鸢尾素。
11、在此，术语"重组dna"指的是通过结合(可能)不同来源的遗传物质而人工获得的dna序列，例如含有目标基因的质粒。
12、在本专利技术的实施方式中，鸢尾素为非糖基化形式或轻度糖基化形式。
13、生产非糖基化或轻度糖基化的鸢尾素相较于生产糖基化的鸢尾素(即与大多数分子为糖基化形式的鸢尾素生产相比)具有多项优势。事实上，令人惊讶的是，已发现生产非糖基化或轻度糖基化鸢尾素的产量显著高于生产糖基化鸢尾素的产量(即与大多数分子为糖基化形式的鸢尾素生产相比)。特别是，蛋白质印迹(western blot)和elisa检测使得能够观察到适用于生产糖基化鸢尾素(即与大多数分子为糖基化形式的鸢尾素生产相比)的方法如何不能以显著数量生产鸢尾素。
14、例如，非糖基化鸢尾素的生产可以通过使用不包括能够将鸢尾素导向内质网的信号肽编码序列的基因序列来实现。
15、例如，轻度糖基化鸢尾素的生产可以通过使用包括编码kdel标签的基因序列来实现，其使得鸢尾素维持在内质网中。
16、编码鸢尾素的核苷酸序列目前可在商业上获得，可以质粒的形式获得，优选为包含该核苷酸序列的puc57质粒(例如，来自新泽西州皮斯卡特维的genscript)。
17、编码鸢尾素的序列可以通过使用适当的限制酶从原始质粒中分离出来，例如bamhi和xmai限制酶。
18、在将编码鸢尾素的核苷酸序列插入适合于插入植物材料的表达载体之前，可以先将该序列插入中间载体(或扩增载体)中，以便进行扩增，即便于生成该序列的大量拷贝。包含编码鸢尾素的序列的中间载体用于转化大肠杆菌细胞。然后对大肠杆菌细胞进行培养，在细胞生长结束时，纯化包含编码鸢尾素的序列的中间载体。
19、因此，在实施方式中，根据本专利技术的方法包括一个预备步骤，即在步骤a)之前，其中将包含编码鸢尾素的核苷酸序列的中间载体(或扩增载体)插入大肠杆菌中，并通过培养该大肠杆菌进行扩增。
20、优选中间载体为质粒，更优选为pgem-nos质粒。
21、在上述预备扩增步骤之后，将编码鸢尾素的序列插入表达载体中，优选还与具有植物终止子功能的序列一起插入，优选为nos-ter终止子。终止子是能够终止基因转录的序列，允许表达载体整合到植物基因组中。nos-ter终止子在本
中是一个已知的终止子。在实施方式中，编码鸢尾素的序列被插入到表达载体中，优选与具有植物终止子功能的序列一起插入，任选地在大肠杆菌中扩增后进行插入。
22、在大肠杆菌中扩增后，纯化包含编码鸢尾素的序列的中间载体，并从中提取编码鸢尾素的序列，优选地与具有植物终止子功能的序列(例如，nos-ter)一起提取，然后插入到表达载体中。
23、在实施方式中，表达载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产鸢尾素的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，还包括在所述步骤a)之前，将包含所述编码鸢尾素的核苷酸序列的扩增载体插入大肠杆菌中并通过培养所述大肠杆菌进行扩增的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述鸢尾素是非糖基化鸢尾素。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述鸢尾素经部分糖基化，并且其中所述方法还包括去除糖基化的步骤，从而获得非糖基化鸢尾素。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述植物材料选自植物或所述植物的至少一部分或所述植物的至少一个细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述植物材料选自：烟草(优选的为本氏烟草)、火麻、螺旋藻、小球藻、拟南芥、玉米、水稻、大豆、油菜、苜蓿、向日葵、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、土豆、生菜和辣椒，或至少所述植物的一部分或所述植物的至少一个细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤c)还包括用农杆菌属的至少一种农杆菌属的第二细菌处理所述至少一种植物材料的步骤，所述第二细菌包含表达载体，所述表达载体包含适于防止所述经处理植物材料中所述鸢尾素表
8.如权利要求7所述的方法，其中，在所述步骤c)中，用混合物处理所述至少一种植物材料，所述混合物包含所述第一细菌和所述第二细菌，所述第一细菌包含所述表达载体，所述表达载体包含编码所述鸢尾素的核苷酸序列，所述第二细菌包含适于防止所述经处理植物材料中所述鸢尾蛋白表达沉默的基因。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述农杆菌属的细菌是根癌农杆菌。
10.如权利要求7所述的方法，其中适于防止鸢尾素表达沉默的基因是P19基因。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述表达载体是pJL-TRBO质粒，其中去除了限制位点pBluescriptKS、Pvu I、GFP-R、BstZ17 I和GFP-F，并插入了限制位点Sal I、Mlu I、NheI、Bmt I、Eco53k I、Sac I、Nco I、Nru I、Asc I–BssH II、ApaL I、AsiS I、Swa I、Kas I、Nar I、Sfo I、PluT I、Avr II。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述编码鸢尾素的核苷酸序列包含在合成基因中，除了包含所述编码鸢尾素的序列外，所述合成基因还包含编码用于从紫花苜蓿苜蓿二硫化物异构酶分泌的N-末端信号肽的多核苷酸序列；编码凝血酶切割位点的序列，接着是编码8个组氨酸残基尾部的序列和编码KDEL末端尾部的序列，其中编码鸢尾素的核苷酸序列位于编码用于从紫花苜蓿苜蓿二硫化物异构酶分泌的N末端信号肽的多核苷酸序列和编码凝血酶切割位点的序列之间。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述编码鸢尾素的核苷酸序列是：GGATCCGATTCTCCTTCAGCTCCAGTTAATGTTACAGTTAGACATCTTAAGGCTAATTCTGCTGTTGTTTCATGGGATGTTTTGGAAGATGAGGTTGTTATTGGTTTTGCTATCTCTCAACAGAAGAAAGATGTTAGAATGCTTAGGTTCATCCAAGAAGTTAACACTACAACTAGGTCTTGTGCTCTTTGGGATTTGGAAGAGGATACAGAGTACATCGTTCATGTTCAGGCTATCTCAATCCAAGGACAGTCTCCTGCTTCAGAACCAGTTTTGTTTAAAACTCCTAGGGAGGCTGAGAAAATGGCAAGTAAAAACAAGGATGAGGTGACAATGAAAGAGTGATAGCCCGGG(SEQ.ID.NO.2)。
14.一种包含在脂质体中的鸢尾素。
15.如权利要求14所述的包含在脂质体中的鸢尾素，其中所述鸢尾素是非糖基化鸢尾素。
16.如权利要求14所述的包含在脂质体中的鸢尾素，其中所述鸢尾素包封于所述脂质体中。
17.所述的包含在脂质体中的鸢尾素，其中所述脂质体包含卵磷脂和壳聚糖。
18.包含在脂质体中的鸢尾素用作药物。
19.如权利要求18所述的包含在脂质体中的鸢尾素，用于治疗和/或预防一种或多种疾病，所述疾病选自骨质疏松症、肌肉减少症、能量代谢紊乱、心血管系统疾病、神经退行性疾病、糖尿病、肥胖、肾脏疾病和代谢性疾病。
20.如权利要求18或19所述应用的鸢尾素，其中所述包含在脂质体中的鸢尾素通过舌下和/或皮下和/或皮内途径通过皮肤凝胶给药，和/或通过鼻腔途径通过鼻喷雾剂给药。
21.一种在植物中表达鸢尾素的合成基因，其包含：编码用于从紫花苜蓿苜...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种生产鸢尾素的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，还包括在所述步骤a)之前，将包含所述编码鸢尾素的核苷酸序列的扩增载体插入大肠杆菌中并通过培养所述大肠杆菌进行扩增的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述鸢尾素是非糖基化鸢尾素。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述鸢尾素经部分糖基化，并且其中所述方法还包括去除糖基化的步骤，从而获得非糖基化鸢尾素。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述植物材料选自植物或所述植物的至少一部分或所述植物的至少一个细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述植物材料选自：烟草(优选的为本氏烟草)、火麻、螺旋藻、小球藻、拟南芥、玉米、水稻、大豆、油菜、苜蓿、向日葵、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、土豆、生菜和辣椒，或至少所述植物的一部分或所述植物的至少一个细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤c)还包括用农杆菌属的至少一种农杆菌属的第二细菌处理所述至少一种植物材料的步骤，所述第二细菌包含表达载体，所述表达载体包含适于防止所述经处理植物材料中所述鸢尾素表达沉默的基因。
8.如权利要求7所述的方法，其中，在所述步骤c)中，用混合物处理所述至少一种植物材料，所述混合物包含所述第一细菌和所述第二细菌，所述第一细菌包含所述表达载体，所述表达载体包含编码所述鸢尾素的核苷酸序列，所述第二细菌包含适于防止所述经处理植物材料中所述鸢尾蛋白表达沉默的基因。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述农杆菌属的细菌是根癌农杆菌。
10.如权利要求7所述的方法，其中适于防止鸢尾素表达沉默的基因是p19基因。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述表达载体是pjl-trbo质粒，其中去除了限制位点pbluescriptks、pvu i、gfp-r、bstz17 i和gfp-f，并插入了限制位点sal i、mlu i、nhei、bmt i、eco53k i、sac i、nco i、nru i、asc i–bssh ii、apal i、asis i、swa i、kas i、nar i、sfo i、plut i、avr ii。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述编码鸢尾素的核苷酸序列包含在合成基因中，除了包含所述编码鸢尾素的序列外，所述合成基因还包含编码用于从紫花苜蓿苜蓿二硫化物异构酶分...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·格拉诺，S·C·科卢西，G·科拉亚尼，R·泽罗廷，P·皮格纳塔罗，
申请(专利权)人：巴里大学，
类型：发明
国别省市：
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