【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物质能源领域，具体涉及一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法。
技术介绍
1、生物质能源相较传统化石能源在环保性和经济性上有得天独厚的优势，以微藻为原料制备的生物柴油在燃烧性能上与化石燃油具有相似的物理化学性质（碳链长度、能量密度等），但燃烧效率和减少sox、nox等有毒气体排放方面均优于化石燃油，更趋于可持续发展理念。目前利用微藻制备生物柴油仍面临许多限制和挑战，最大的困难是原料藻种油脂产率相对较低导致下游加工成本（如提纯、转化等）居高不下。
2、通过育种能有效提高微藻油脂产率，降低后续加工的经济成本。等离子体诱变育种在操作上较为简单的同时还具有杰出的诱变效率，是一种应用前景广阔的育种技术。另一方面，诱变具有随机性，以往特征微藻诱变的筛选包括直接指标（如油脂含量、比生长率等）、直接指标组合对比或表型功能性筛选，存在测试量大、筛选周期长、效率低下的问题。近年来也出现利用自动化设备高通量筛选的方法，尽管此类方法筛选速度快、效率高，但其昂贵的设备成本是广泛应用的最大阻碍。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，解决了现有的高产油微藻的筛选方法存在效率低或成本高的缺陷。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法， 包括以下步骤：
4、步骤1，将待诱变藻液培养至对数期，得到藻液培养液，
5、步骤2，利用等离子体将藻液进行诱变，得到诱变藻落；
6、步骤3，将得到的诱变藻落进行稀释，得到稀释后的藻液；
7、步骤4，将得到的稀释后的藻液均匀涂布于含有抑制剂的固体培养基上进行培养，得到突变藻株；
8、步骤5，从得到的突变藻株中筛选得到高产油突变藻株；
9、其中，含有抑制剂的固体培养基制备方法是：
10、将碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚添加至液体培养基中，形成含有抑制剂的固体培养基。
11、优选地，步骤1中，藻液的浓度为（1～2）×106个/ml。
12、优选地，步骤2中，利用等离子体将藻液进行诱变，得到诱变藻落，具体方法是：
13、将藻液放入等离子体反应釜中，以设定的输入电压、电流和空气流量对藻液进行不同时间的诱变，得到不同时间对应的初始诱变藻液；
14、计算不同时间对应的初始诱变藻液的致死率；
15、从致死率大于设定阈值的初始诱变藻液中获取得到诱变藻落。
16、优选地，步骤3中，将得到的诱变藻液进行稀释，得到稀释后的藻液，具体方法是：
17、将得到的诱变藻落放置灭菌后的甘油保护液中进行暗适应，得到稀释后的藻液，其中，稀释后的藻液浓度为（0.5～1）×104个/ml。
18、优选地，所述甘油保护液由甘油和bg-11液体培养基组成，其中，甘油保护液中的甘油体积分数为10%。
19、优选地，碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚添加至液体培养基后分别浓度为0.001 mm/l、0.2mm/l和0.12 mm/l。
20、优选地，步骤5，从得到的突变藻株中筛选得到高产油突变藻株，具体方法是：
21、将得到的突变藻株接种于bg-11液体培养基中并置于恒温光照培养箱内进行分批培养，在对突变藻株进行培养过程中，利用三指标筛选原则筛选得到高产油突变藻株。
22、优选地，三指标筛选原则具体是：
23、以比生长速率大于正常株的10%，且以相对荧光值大于正常株20%为第一筛选原则；
24、以比生长速率和相对荧光值的乘积值大于对照株的35%为第二筛选原则。
25、一种产油微藻，基于所述方法筛选得到。
26、一种用于筛选产油微藻的组合抑制剂，包括碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚，其中，碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚添加至液体培养基后浓度分别为0.001 mm/l 、0.2mm/l和0.12mm/l。
27、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
28、本专利技术提供的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，通过dbd等离子体对藻液进行诱变，并利用添加组合抑制剂的固体培养基进行初筛和三指标筛选原则复筛的方法，在提高筛选效率、减少测试工作量的前提下能保证筛选的准确性，对筛选设备的要求较低，使该专利技术的适用性广泛，任何实验室均可完成。
29、进一步的，碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚三种酶抑制剂组合添加至bg-11培养基作为初筛能过滤掉一部分特征油脂积累潜力弱的藻株（能在抑制剂固体平板上长出的藻落，说明诱变提高了相应酶活性，突破了抑制，具有强大的特征油脂积累潜力）。
30、进一步的，本专利技术利用dbd等离子体先通过致死率获得最佳诱变时间，同时根据抑制剂液体培养和固体培养效果确定组合添加至固体筛选培养基的浓度，建立组合抑制剂固体培养基初筛平台。在此基础上对最佳诱变时间下的突变藻株进行抑制剂初筛和综合指标精确筛选，获得了最终高产油突变藻株。相比较目前已有的筛选方法，该筛选办法可以减少指标测试带来的工作量，节省筛选时间，可以更有效地筛选出目标藻株。
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1.一种用于筛选产油微藻的组合抑制剂，其特征在于，包括碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚，其中，碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚添加至液体培养基后浓度分别为0.001 mM/L 、0.2mM/L和0.12 mM/L。
2.一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤1中，藻液的浓度为（1～2）×106个/mL。
4.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤2中，利用等离子体将藻液进行诱变，得到诱变藻落，具体方法是：
5.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤3中，将得到的诱变藻液进行稀释，得到稀释后的藻液，具体方法是：
6.根据权利要求5所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，所述甘油保护液由甘油和BG-11液体培养基组成，其中，甘油保护液中的甘油体积分数为10%。
7.根据权利要求2
8.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤5，从得到的突变藻株中筛选得到高产油突变藻株，具体方法是：
9.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，三指标筛选原则具体是：
10.一种产油微藻，其特征在于，基于权利要求2所述方法筛选得到。
...【技术特征摘要】
1.一种用于筛选产油微藻的组合抑制剂，其特征在于，包括碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚，其中，碘乙酸、精喹禾灵和芝麻酚添加至液体培养基后浓度分别为0.001 mm/l 、0.2mm/l和0.12 mm/l。
2.一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤1中，藻液的浓度为（1～2）×106个/ml。
4.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤2中，利用等离子体将藻液进行诱变，得到诱变藻落，具体方法是：
5.根据权利要求2所述的一种组合抑制剂协同等离子体诱变筛选产油微藻的方法，其特征在于，步骤3中，将得到的诱变藻液进行稀释，得到稀释后的藻液，具体方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏飞，邹涛圳，张卓婷，何绪豪，李瑞丹，
申请(专利权)人：江西理工大学，
类型：发明
国别省市：
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