一种快速迭代获取长片段DNA高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法技术

本发明专利技术属于基因工程和代谢工程领域，公开了一种快速迭代获取长片段DNA高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法。借助CRISPR‑Cas9基因编辑技术，将营养缺陷基因弱化回补的筛选策略与delta序列/rDNA序列多拷贝整合策略结合，构建一种快速迭代获取长片段DNA高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，以应用于产天然产物的酿酒酵母工程菌的构建。应用本发明专利技术，实现了麦角硫因和虫草素两种天然产物产量的大幅提高。这一快速迭代获取长片段DNA高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法将有助于开发酿酒酵母工程菌应用于天然产物的高效生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和代谢工程领域，具体涉及一种快速迭代获取长片段dna高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法。

技术介绍

1、天然产物是自然界中来自动、植物以及微生物的有机小分子化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等非常重要的生物活性及生理功能。据统计，现代临床药物中有大约40％直接或间接来自于天然产物。2015年诺贝尔生理学或医学奖授予了中国药学家屠呦呦、爱尔兰科学家坎贝尔和日本科学家大村智，以表彰他们对植物来源的青蒿素和真菌来源的阿维菌素的研究所做出的巨大贡献，这一奖项的颁布更增加了天然产物的研究热度。目前，天然产物的生产主要通过植物提取和化学合成，然而传统合成方法往往受到很多限制。利用合成生物学等现代生物技术构建微生物细胞工厂来异源生物合成天然产物，可以突破传统生产手段的瓶颈，为天然产物的绿色高效低成本合成提供了新的策略，进而推动天然产物的研究和应用。近年来，随着合成生物学的飞速发展，已经有很多天然产物通过微生物异源合成取得重要进展。

2、酿酒酵母作为一种模式真菌，具有生物安全性高、易培养、遗传背景清晰、基因编辑技术成熟、适合大规模发酵生产等优势本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种快速迭代获取长片段DNA高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，其特征是，所述方法为借助CRISPR-Cas9基因编辑技术，将营养缺陷基因弱化回补的筛选策略与delta序列/rDNA序列多拷贝整合策略结合，包括Cas9-gRNA载体的构建、基因组整合片段的扩增、酿酒酵母迭代转化及快速筛选。

2.根据权利要求1所述的快速迭代获取长片段DNA高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，其特征是，Cas9-gRNA载体的构建的方法为：选用适用于酿酒酵母且含有Cas9及sgRNA表达框的游离表达质粒作为出发载体，使用限制性内切酶对出发载体进行双酶切，将sgRNA表达框切除，获得线性化载体，根...

【技术特征摘要】

1.一种快速迭代获取长片段dna高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，其特征是，所述方法为借助crispr-cas9基因编辑技术，将营养缺陷基因弱化回补的筛选策略与delta序列/rdna序列多拷贝整合策略结合，包括cas9-grna载体的构建、基因组整合片段的扩增、酿酒酵母迭代转化及快速筛选。

2.根据权利要求1所述的快速迭代获取长片段dna高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，其特征是，cas9-grna载体的构建的方法为：选用适用于酿酒酵母且含有cas9及sgrna表达框的游离表达质粒作为出发载体，使用限制性内切酶对出发载体进行双酶切，将sgrna表达框切除，获得线性化载体，根据酿酒酵母多拷贝整合位点：delta位点和rdna位点的序列分别设计2对sgrna，通过酶切连接或overlap pcr构建含有目标sgrna序列的4个sgrna表达框，其片段核苷酸序列如seq id no.1-4所示，进一步通过酶切连接或无缝克隆将其连接到线性化载体上，构建cas9-grna载体。

3.根据权利要求1所述的快速迭代获取长片段dna高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，其特征是，基因组整合片段的扩增的方法为：通过overlap pcr扩增供体dna片段，包括目的基因表达框、弱启动子驱动营养缺陷标记基因表达框及左右同源臂。

4.根据权利要求1所述的快速迭代获取长片段dna高拷贝整合的酿酒酵母重组子的方法，其特征是，酿酒酵母迭代转化的方法为：制备酿酒酵母感受态细胞，将适量cas9-grna质粒和相应的donor dna片段进行电击转化后涂布于营...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，陈喜媚，邱鑫，李倩，陈明，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：