一种纳米孔膜蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米孔膜蛋白的制备方法，涉及纳米孔检测技术蛋白制备领域，包括步骤一、定制合成的蛋白编码基因，在对应的载体中构建质粒DNA；步骤二、使用热激法将上述质粒DNA载体转入大肠杆菌表达菌株中进行诱导培养，用于目标蛋白的表达和纯化；步骤三、超声破碎菌体，然后磁珠纯化得到膜蛋白；步骤四、电泳表征及纳米孔成孔与易位检测。本发明专利技术采用破碎与磁珠纯化相结合的方法，不需要复杂的镍柱纯化，降低人工操作的时间和单批制备的成本，大大提高了膜蛋白的制备效率和质量，能够实现膜蛋白的量产，提高蛋白的纯度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米孔检测技术蛋白制备领域，具体涉及一种纳米孔膜蛋白的制备方法。

技术介绍

1、近些年来，纳米孔膜蛋白作为传感器、测序器或单分子反应器在科研和医疗领域展现出了巨大的应用潜力。这些纳米孔膜蛋白能够精确识别并操作单个生物分子，从而为实现高效的生物检测和药物研发提供了可能。

2、在纳米孔膜蛋白的制备过程中，液相色谱技术（如纳米液相色谱）发挥着关键作用。该技术通过精确控制样品在色谱柱中的流动和分离，能够有效地将目标蛋白质从复杂的生物样本中分离出来。然而，液相色谱技术的应用通常依赖于昂贵的蛋白质层析仪（fplc）和相应的镍柱。fplc系统通过高压泵驱动流动相，使样品在色谱柱中发生吸附、解吸和分离。镍柱则利用过渡金属镍与蛋白质中特定氨基酸（如组氨酸）的亲和力，实现对目标蛋白质的特异性吸附和分离。这种组合虽然能够制备出高纯度的纳米孔膜蛋白，但使其依然存在有诸多不足，例如fplc系统通常需要较长的时间来完成一次蛋白质分离过程，其低通量特性限制了其处理大量样品的能力；并且fplc系统及其配套的镍柱价格昂贵，增加了制备纳米孔膜蛋白的成本；fplc系统本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1中能够选择αHL、MspA、Omp家族、FraC、CsgG、FhuA或者Aerolysin中常用纳米孔膜蛋白中的一种；在纳米孔膜蛋白的c端位于孔前庭的外表面，添加一个六组氨酸标记。

3.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1中重组质粒以pET系列载体为表达载体。

4.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤3中破碎细菌菌体用破碎Buffer，4 M Urea，50 mM T...

【技术特征摘要】

1.一种纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1中能够选择αhl、mspa、omp家族、frac、csgg、fhua或者aerolysin中常用纳米孔膜蛋白中的一种；在纳米孔膜蛋白的c端位于孔前庭的外表面，添加一个六组氨酸标记。

3.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1中重组质粒以pet系列载体为表达载体。

4.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤3中破碎细菌菌体用破碎buffer，4 m urea，50 mm tris，300 mm nacl，ph 8.0，溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率60 w，20 min，超声2 s，暂停6 s为一个循环；超声完毕后，金属浴90℃加热10min，然后12000 rpm，4℃，离心40 min，然后收集上清，用作磁珠纯化。

5.根据权利要求1所述的纳米孔膜蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤3中磁珠为ni2+磁珠，上清液加入磁珠后，在室温旋转混合器上摇晃60 min；磁分离后，弃用上清液；然后加入1 ml洗涤缓冲液a；将珠子在室温下重悬，并在旋转混合器上下摇匀5 min；磁分离后，弃用上清液；磁分离后，弃用上清液；然后加入100µl洗脱缓冲液b1；珠子重悬，在室温旋转混合器上再...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘航，李贝贝，童京京，杨达奇，吴亚慧，孙标标，雷炳旭，
申请(专利权)人：河南省华之源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：