【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及手性邻二醇类化合物合成，具体而言，涉及一种p450单加氧酶(命名为p450da-m1)和环氧水解酶(命名为speh)级联催化反应的构建及其在生物合成手性邻二醇类化合物的应用。
技术介绍
1、手性邻二醇类化合物是一类非常重要的化合物,可作为药物中间体以及催化剂中间体,在有机合成和药物合成中有广泛的应用。现有的手性邻二醇类化合物合成技术还存在着使用过渡金属催化、副产物多、立体选择性差、反应条件苛刻等不足。生物酶的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备手性邻二醇类化合物的新途径。但现有研究表明，高活性和高区域选择性的手性邻二醇类化合物合成酶还十分匮乏，因此，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是手性邻二醇类化合物生物催化制备发展过程中的难点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种p450单加氧酶(命名为p450da-m1)和环氧水解酶(命名为speh)级联催化反应的构建及其在生物合成手性邻二醇类化合物的应用以解决上述技术问题。
2、本专利技术的技术方案：
3、一种手性邻二醇类化合物的制备方法，其特征为烯丙基苯为底物、p450da-m1单加氧酶和环氧水解酶speh为催化剂，双酶级联反应构建，在水相条件下反应，反应式如下:
4、
5、其中：
6、r为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、溴苯基、氯苯基、氟苯基、2-呋喃基、2-噻吩基。
8、第一方面，本专利技术提供了一种p450单加氧酶p450da-m1，其氨基酸序列如seq idno.1所示；本专利技术提供了一种环氧水解酶speh，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
9、本专利技术中的p450单加氧酶p450da-m1和环氧水解酶speh基因，将其构建到基因工程菌上，经过诱导表达，获得了p450单加氧酶和环氧水解酶。发现该p450单加氧酶和水解酶级联反应合成手性邻二醇类化合物的功能。相对于现有的手性邻二醇类化合物的制备方法，使用本专利技术提供的双酶级联反应进行生物合成手性邻二醇类化合物，具有反应速率高，无需中间体分离和耗时短的技术优势；本专利技术提供的单加氧酶p450da-m1和环氧水解酶speh双酶级联在合成手性邻二醇类化合物时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和；此外，本专利技术提供的单加氧酶p450da-m1和环氧水解酶speh双酶级联在合成手性邻二醇类化合物时，不需使用过渡金属或有毒试剂，因此，本专利技术提供的单加氧酶p450da-m1和环氧水解酶speh双酶级联具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便。
10、上述单加氧酶中含有血红素单元。
11、seq id no.1所示的单加氧酶p450da-m1氨基酸序列如下：
12、
13、第二方面，本专利技术还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的单加氧酶p450da-m1，分离的核酸分子具有如下seq id no.2所示的核苷酸序列：
14、
15、
16、
17、第三方面，seq id no.3所示的环氧水解酶speh氨基酸序列如下：
18、
19、第四方面，本专利技术还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的环氧水解酶speh，分离的核酸分子具有如下seq idno.4所示的核苷酸序列：
20、
21、
22、第五方面，本专利技术还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子。
23、载体包括不限于细菌表达载体、真菌表达载体等，只要能实现上述核酸分子的表达、实现上述核酸分子的穿梭的载体均可行。包括不限于，质粒等。细菌表达载体如大肠杆菌表达载体、链霉菌或分枝杆菌表达载体。真菌表达载体例如酵母载体。
24、第六方面，本专利技术还提供了一种重组菌，其包括上述的载体。
25、在本专利技术应用较佳的实施方式中，重组菌为细菌或真菌；
26、在本专利技术应用较佳的实施方式中，细菌为大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。
27、真菌例如酵母。
28、在本专利技术应用较佳的实施方式中，重组菌是指菌的休止细胞、重组菌的活细胞、重组菌的死菌和重组菌的细胞破碎物中的至少一种。
29、上述重组菌(或基因工程菌)，由通过本领域常规方法将重组表达载体转化至宿主微生物中制得；宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的p450单加氧酶和环氧水解酶基因可被有效表达即可；较佳地，可通过下述方法制得:将重组载体pet-28a(+)-p450和pet-22a(+)-speh转化至大肠杆菌bl21(de3)中。
30、休止细胞，也称为静息细胞，是一种特殊的细胞状态。在这种状态下，细胞不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，并具有氧化和发酵能力。在适宜的条件下，休止细胞可以重新恢复生长。休止细胞的特点包括：a.细胞保持生长潜力：尽管处于休眠状态，但在给予适当刺激时，这些细胞可以重新进入细胞周期并恢复增殖能力。b.专一性强：休止细胞在反应中的专一性较强，可以提高底物转化率。c.不易染杂菌：由于其特性，休止细胞在使用过程中可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。
31、第七方面，本专利技术还提供了一种固定化细胞，将上述的菌或上述的细胞进行固定制得。
32、在本专利技术应用较佳的实施方式中，通过载体进行细胞固定的方法选自吸附法、共价结合法、交联法和微胶囊法中的至少一种。
33、吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将细胞吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。
34、共价结合法是利用细胞表面的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。
35、交联法是采用双功能或多功能试剂与细胞表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得细胞被固定。
36、包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化细胞。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将细胞与胶溶液混合，经造粒而成。
37、在本专利技术应用较佳的实施方式中，固定化细胞是活菌或死菌的固定化细胞。
38、第八方面，本专利技术还提供了p450单加氧酶和环氧水解酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞在手性邻二醇类化合物生物合成中的应用。
39、p450单加氧酶包括不限于纯化后的重组p450单加氧酶蛋白，含p450单加氧酶的粗酶液。
40、采用上述p450单加氧酶和环氧水解酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞能够高效、快速、简便的在常温、常压及水相环境中实现手性邻二醇类化合物生物合成，整个合成过程对环境友好，具有广阔的应用前本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种P450单加氧酶和环氧水解酶，其特征在于，P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQID No.1所示；环氧水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的P450单加氧酶P450DA-M1和环氧水解酶SpEH。
3.一种载体，其特征在于，其包括权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组菌，其特征在于，其包括权利要求3所述的载体；
5.一种重组细胞，其特征在于，其包括权利要求3所述的载体，所述重组细胞为昆虫细胞。
6.一种固定化细胞，其特征在于，将权利要求4所述的重组菌或权利要求5所述的重组细胞进行固定制得；
7.如权利要求1所述的P450单加氧酶和环氧水解酶、如权利要求4所述的重组菌、权利要求5所述的重组细胞、权利要求6所述的固定化酶在手性邻二醇类化合物生物合成中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述手性邻二醇类化合物生物合成的底物为烯丙基苯类分子。
9.一种生物合成手性邻二醇类化合物的方法，其特征在于，采用权
10.一种手性邻二醇类化合物的制备方法，其特征在于，烯丙基苯为底物、P450DA-M1单加氧酶和环氧水解酶SpEH为催化剂，构建双酶级联反应体系，在水相条件下反应，反应式如下:
...【技术特征摘要】
1.一种p450单加氧酶和环氧水解酶，其特征在于，p450单加氧酶的氨基酸序列如seqid no.1所示；环氧水解酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的p450单加氧酶p450da-m1和环氧水解酶speh。
3.一种载体，其特征在于，其包括权利要求2所述的核酸分子。
4.一种重组菌，其特征在于，其包括权利要求3所述的载体；
5.一种重组细胞，其特征在于，其包括权利要求3所述的载体，所述重组细胞为昆虫细胞。
6.一种固定化细胞，其特征在于，将权利要求4所述的重组菌或权利要求5所述的重组细胞进行固定制得；
7.如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：周晓建，陈永正，彭雨欣，敖娟，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：
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