经改变的胞苷脱氨酶和使用方法技术

本公开涉及用于对包括5‑甲基胞嘧啶和5‑羟甲基胞嘧啶(5hmC)的核酸的甲基化状态进行标测的蛋白质、方法、组合物和试剂盒。在一个实施方案中，提供了选择性地作用于靶核酸的某些经修饰的胞嘧啶并且将它们转化为胸苷或经修饰的胸苷类似物的蛋白质。在另一个实施方案中，提供了选择性地作用于靶核酸的某些经修饰的胞嘧啶并且将它们转化为尿嘧啶或胸苷而选择性不作用于靶核酸的其他某些经修饰的胞嘧啶的蛋白质。还提供了包括所述蛋白质中的一种或多种蛋白质的组合物和试剂盒，以及使用所述蛋白质中的一种或多种方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本公开的实施方案涉及制备用于测序或其他应用的核酸。具体而言，本文提供的蛋白质、方法、组合物和试剂盒的实施方案涉及通过使用测序文库和其他方法进行的甲基化状态的标测。

技术介绍

1、经修饰的dna胞嘧啶，包括5-甲基胞嘧啶(5mc)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)，是深入研究的表观遗传修饰，它在人类发育和疾病中发挥基本作用。它的全基因组分布在组织类型之间以及在健康状态和疾病状态之间是不同的。近年来，5mc作为临床诊断工具也受到关注：它在从液体活检样品获得的无细胞dna(cfdna)中的分布可用于早期癌症的组织特异性预测或者治疗后癌症复发或缓解的监测。因此，在样品dna数量、质量和复杂性损失最小的情况下，以单碱基分辨率对经修饰的dna胞嘧啶进行标测的方法的开发已得到密切关注。然而，目前用于对经修饰的dna胞嘧啶进行标测的方法显示出局限性，这些局限性包括(i)由于在非中性ph和高温处进行的长期化学处理而导致样品dna降解，(ii)由于未甲基化的dna碱基转化为尿嘧啶而导致样品dna复杂性丧失，从而产生低复杂性基因组标测，(iii)多步转化同时需要酶和化学处理，以及(本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种经改变的胞苷脱氨酶，所述经改变的胞苷脱氨酶包含胞苷脱氨酶中在功能上等同于野生型APOBEC3A蛋白中的(Tyr/Phe)130和Tyr132的位置处的氨基酸取代突变。

2.一种经改变的胞苷脱氨酶，所述经改变的胞苷脱氨酶包含胞苷脱氨酶中在功能上等同于野生型APOBEC3A蛋白中的(Tyr/Phe)130的位置处的氨基酸取代突变，其中所述取代突变是(Tyr/Phe)130Trp。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述(Tyr/Phe)130是Tyr130，并且所述野生型APOBEC3A蛋白是SEQ ID NO:3。

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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.一种经改变的胞苷脱氨酶，所述经改变的胞苷脱氨酶包含胞苷脱氨酶中在功能上等同于野生型apobec3a蛋白中的(tyr/phe)130和tyr132的位置处的氨基酸取代突变。

2.一种经改变的胞苷脱氨酶，所述经改变的胞苷脱氨酶包含胞苷脱氨酶中在功能上等同于野生型apobec3a蛋白中的(tyr/phe)130的位置处的氨基酸取代突变，其中所述取代突变是(tyr/phe)130trp。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述(tyr/phe)130是tyr130，并且所述野生型apobec3a蛋白是seq id no:3。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中在功能上等同于tyr130的位置处的所述取代突变包括向ala、val或trp的突变。

5.根据权利要求2或权利要求4所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中在功能上等同于tyr132的位置处的所述取代突变包括向his、arg、gln或lys的突变。

6.根据权利要求1所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶通过脱氨使5-甲基胞嘧啶(5mc)转化为胸苷(t)的速率大于通过脱氨使胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)的速率。

7.根据权利要求6所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述速率为至少100倍大。

8.根据权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶通过脱氨使胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)以及通过脱氨使5-甲基胞嘧啶(5mc)转化为胸苷(t)的速率大于通过脱氨使5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)转化为5-羟甲基尿嘧啶(5hmu)的速率。

9.根据权利要求8所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中通过脱氨使5hmc转化为5hmu是检测不到的。

10.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶是aid亚家族、apobec1亚家族、apobec2亚家族、apobec3a亚家族、apobec3b亚家族、apobec3c亚家族、apobec3d亚家族、apobec3f亚家族、apobec3g亚家族、apobec3h亚家族或apobec4亚家族的成员。

11.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶包含zdd基序h-[p/a/v]-e-x[23-28]-p-c-x[2-4]-c(seq id no:12)。

12.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶是所述apobec3a亚家族的成员，并且包含zdd基序hxex24sw(s/t)pcx[2-4]cx6fx8lx5r(l/i)yx[8-11]lx2lx[10]m(seq id no:13)，其中在功能上等同于所述野生型apobec3a蛋白的(tyr/phe)130的位置处的所述氨基酸取代突变是所述zdd基序的tyr(y)氨基酸。

13.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶是所述apobec3a亚家族的成员，并且包含x[16-26]-grxxtxlcyxv-x15-gxxxn-x12-haexxf-x14-yxxtwxxswspc-x[2-4]-ca-x5-fl-x7-lxixxxr(l/i)y-x8-glxxlxxxg-x5-m-x4-fxxcwxxfv-x6-fxpw-x13-lxxi-x[2-6](seq id no:14)。

14.根据权利要求1或权利要求2所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中所述经改变的胞苷脱氨酶是所述apobec3a家族的成员，并且包含seq id no:16、seq id no:17或seq id no:59。

15.根据权利要求14所述的经改变的胞苷脱氨酶，其中在功能上等同于tyr130的位置处的所述取代突变包括向丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、精氨酸或苏氨酸的突变。

16.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的经改变的胞苷脱氨酶。

17.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至权利要求15中任一项所述的经改变的胞苷脱氨酶以及缓冲液。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物还包含：

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述dna包括单链dna。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述经改变的胞苷脱氨酶包含在功能上等同于野生型apobec3a蛋白中的tyr132的位置处的氨基酸取代突变。

21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述样品包含基因组dna或无细胞dna。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述基因组dna来自单个细胞或来自多个细胞的混合物。

23.根据权利要求17所述的组合物，其中在功能上等同于tyr130的位置处的所述取代突变包括向丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、精氨酸或苏氨酸的突变，并且其中所述经改变的胞苷脱氨酶通过脱氨使5-甲基胞嘧啶(5mc)转化为胸苷(t)的速率大于通过脱氨使胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)的速率。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述速率为至少100倍大。

25.根据权利要求18所述的组合物，其中在功能上等同于(tyr/phe)130的位置处的所述取代突变包括向trp的突变，并且其中至少一个5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)存在于所述dna中，并且其中所述经改变的胞苷脱氨酶通过脱氨使胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)以及通过脱氨使5-甲基胞嘧啶(5mc)转化为胸苷(t)的速率大于通过脱氨使5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)转化为5-羟甲基尿嘧啶(5hmu)的速率。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中通过脱氨使5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)转化为5-羟甲基尿嘧啶(5hmu)是检测不到的。

27.一种方法，所述方法包括：

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法还包括，在所述提供之前，使存在于所述样品中的双链dn...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·卓，L·Y·M·贝，S·T·谭，A·特拉济科，S·尼兰泰尔，E·布拉斯塔德，H·T·戈米，Z·法赫米，L·拉维钱德拉普拉布，C·布朗，K·巴斯比，S·格罗斯，R·卡拉迪马，H·拉姆，P·马森内特，S·E·舒尔扎贝格，K·曾，A·K·杨汉斯，
申请(专利权)人：因美纳有限公司，
类型：发明
国别省市：