一种获得丁醇产生菌突变株的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得丁醇产生菌突变株的方法。该方法包括以下步骤：１）将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；２）将上述步骤１）获得的突变株之间进行原生质体融合，得到融合子；３）将上述步骤２）获得的融合子进行化学诱变，得到突变株；４）将上述步骤３）获得的突变株之间进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株。本发明专利技术以丙酮丁醇梭菌ＳＭＢ１？ＣＧＭＣＣ？Ｎｏ．２２８７为出发菌株，采用化学诱变和原生质体融合交替进行的方法，最终得到对产物有较高耐受性的丁醇产生菌突变菌。采用本发明专利技术方法获得的丁醇产生菌突变株ＤＧＦ４对丁醇的耐受性可达１９ｇ／Ｌ，丁醇的产量为１０．４３ｇ／Ｌ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求 量超过140万吨。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；丁 醇的含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，且不会腐蚀管道，便于管道输送；丁醇的蒸 汽压低，安全性高，能与汽油以任意比混合。 丁醇可用化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条，一是以丙 烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛为原料，经醇 醛縮合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法则是以粮食为原料，经发酵获得丙酮、丁醇、乙醇(三者质量比为3 : 6 : 1)，再经精馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇。发酵法生产丙酮丁醇曾经是仅次于乙醇发酵的全球第二大发酵工业。随着石油价格的不断上涨，使得丙酮丁醇发酵重新获得人们的重视，仅以丁醇为例，国内市场价格在2006 年上半年内由1万元/吨上涨到1. 8万元/吨，仍然供不应求，丁醇发酵工业已迎来复苏产 业的大好时机。在过去20年中，围绕着丁醇产生菌的筛选、丁醇合成的分子遗传机制和调 控、高丁醇比菌种改造、发酵原料的替换、发酵和提取工艺等方面，国内外学者开展了广泛、 深入的研究，为大规模实现丁醇生物制备奠定了基础。 丁醇发酵中，溶剂毒性是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所产生的溶剂中， 丁醇是毒性最大的，当其浓度达到13g/L时，发酵就基本停止。研究发现，丁醇毒性的机制 与其疏水性有关，它会破坏细胞膜的磷脂成份，使膜的流动性提高，可能会导致膜的不稳 定，破坏与膜相关的功能，如抑制与膜结合的ATP酶活性、降低胞内ATP水平、抑制细胞维持 胞内pH的能力、破坏细胞膜的pH梯度等。丁醇毒性对细胞膜的进一步影响是抑制糖和氨 基酸的吸收，从而使代谢完全停滞。由于丁醇毒性是丙酮丁醇发酵中影响溶剂产量最主要 的限制性因素，目前普遍认为提高对丁醇的抗性，可能会提高溶剂的产量。 目前，多以传统诱变选育或扩增耐受丁醇相关的基因来提高产生菌对丁醇的耐受 性。基因工程操作需要准确的基因信息，但与丁醇耐受相关的基因比较多，很可能是多种基 因共同作用的结果，单个或少量基因的过量表达或缺失往往不能达到提高宿主菌丁醇耐受 性的目的，因此突变筛选仍然是获得高丁醇耐受突变株最为有效的途径。但传统的诱变正 突变率很低，筛选工作量大，改良菌种所用周期较长，并且所用的菌种在经过多次诱变后， 会产生对诱变剂的"钝化"现象，导致诱变效率下降。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。 本专利技术所提供的获得丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤 1)将丁醇产生菌进行化学诱变；3 2)将上述步骤1)诱变后的丁醇产生菌之间进行原生质体融合，得到融合子； 3)将上述步骤2)获得的融合子进行化学诱变； 4)将上述步骤3)诱变后的融合子之间再进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突 变株。 上述方法还包括将所述步骤4)获得的丁醇产生菌突变株再进行化学诱变，将经过诱变的丁醇产生菌之间进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株的步骤。 上述过程至少重复一次。 当然，上述获得丁醇产生菌突变株的方法也可以只包括步骤1)_4)的过程。 上述方法中，所述化学诱变所使用的诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或 亚硝基胍。 所述诱变剂为硫酸二乙酯和亚硝基胍，所述硫酸二乙酯的终浓度为0. 2 1%， 具体可为0. 5%，所述诱变时间为10 40min，具体可为15min ;所述亚硝基胍的终浓度为 0. 1 lg/L，具体可为0. 2g/L，所述诱变时间为10 50min，具体可为30min。 上述方法中，所述原生质体融合中，培养突变株的培养基的组成为淀粉10g/L、 硫酸镁0. 2g/L、硫酸锰0. 01g/L、硫酸铁0. 01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0. 5g/L、磷酸氢 二钾0. 5g/L、对氨基苯甲酸lmg/L、生物素2 y g/L、维生素BJmg/L，其余为水。 上述方法中，所述丁醇产生菌可为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutyri固)等，具体可为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) SMB 1CGMCC No. 2287。可将不同的丁醇产生菌之间进行原生质体融合，如将丙酮丁醇梭菌 (Clostridiumacetobutylicum)禾口拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)之间进行原生 质体融合；也可以将不同的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)进行原生质体 融合。 采用上述方法获得的丁醇产生菌突变株也属于本专利技术的保护范围。 上述丁醇产生菌突变株DGF4，经16s rDNA基因序列分析及生理生化特征分析，鉴定为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC N2 2279。 本专利技术的另一个目的是提供一种制备丁醇的方法。 本专利技术所提供的制备丁醇的方法，是培养按照上述方法获得的丁醇产生菌突变 株，得到丁醇。 本专利技术的第三个目的是提供一种原生质体融合用培养基。 本专利技术所提供的原生质体融合用培养基，其组成为淀粉10g/L、硫酸镁0. 2g/L、 硫酸锰0. 01g/L、硫酸铁0. 01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾0. 5g/L、磷酸氢二钾0. 5g/L、对 氨基苯甲酸lmg/L、生物素2ii g/L、维生素BJmg/L，其余为水。 本专利技术以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌 (Clostridiumbeijerinckii)为出发菌株，用诱变剂进行处理，得到丁醇耐受性提高和产量 提高的突变株，将获 的突变株制备成原生质体，进行原生质体融合，从融合子中筛选丁醇耐受性较高的菌株，经产物分析，得到高产融合子；再将所得的融合子进行诱变，将获得的 突变株进行原生质体融合，循环进行以上步骤，最终得到对产物有较高耐受性的丁醇产生 菌突变菌。采用上述方法获得的丁醇产生菌突变株DGF4对丁醇的耐受性可达19g/L，发酵 液中丁醇的产量可达10. 43g/L。 本专利技术方法结合了传统诱变育种和基因组重排技术的优点，无需了解微生物的代 谢途径、生物合成酶编码基因或与菌株生理性状相关的分子基础，通过表型的变化就可对 突变株进行多轮次递进式突变筛选，保留了对产物产生有利的基因并使之得到提高，可以 有效提高正向突变株的筛选效率，縮短突变和菌种筛选的时间和周期。具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 下述实施例中的化学诱变及原生质体融合的操作均在严格厌氧的条件下进行。 实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得丁醇产生菌突变株的方法，包括以下步骤：　　１）将丁醇产生菌进行化学诱变，得到突变株；　　２）将上述步骤１）获得的突变株之间进行原生质体融合，得到融合子；　　３）将上述步骤２）获得的融合子进行化学诱变，得到突变株；　　４）将上述步骤３）获得的突变株之间进行原生质体融合，得到丁醇产生菌突变株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张延平，张天瑞，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]