【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及猪伪狂犬病毒基因分型探针引物组及分型试剂盒和分型方法。
技术介绍
1、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)又称猪疱疹病毒ⅰ型，属于疱疹病毒科的α-疱疹病毒亚科，病毒粒子呈椭圆形或圆形，基因组约143000个碱基对，gc含量高达73％。该病毒以猪为自然宿主，同时可以感染其他家畜或野生动物，引起以中枢神经系统疾病为特征的急性传染病。因其发病症状与狂犬病相似，故命名为伪狂犬病。该病对养猪业造成较大危害，猪日龄越小对伪狂犬病病毒越易感，产房仔猪感染死亡率近100％，而成年猪感染则会引起繁殖障碍，比如引发母猪流产，产死胎或木乃伊胎以及导致公猪性功能异常和繁殖能力下降，从而导致猪场生长速度、育成率及繁殖率等多方面指标下降。prv给全世界生猪养殖产业造成了巨大的经济损失，woah将其列为b类传染病。
2、伪狂犬病弱毒疫苗bartha-k61的大面积使用有效遏制了伪狂犬病的爆发和流行，但是从2011年下半年开始，中国许多免疫过bartha-k61疫苗的规模化猪场爆发了猪伪狂犬病疫情。研究发现，中国新流行的prv毒力明显强于经典毒株，被命名为基因ⅱ型，传统的灭活苗和弱毒苗对不同基因型的prv的交叉保护力有很大的局限性。因此，对猪伪狂犬病毒开展快速、高灵敏的鉴别及诊断就显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术提供了猪伪狂犬病毒基因分型探针引物组及分型试剂盒和分型方法，可准确、特异且高灵敏地区分i型和ii型prv。
2、
3、所述基因分型taqman探针包括以下至少一条：核苷酸序列如seq id no.3所示的i型探针、seq id no.4所示的ii型探针和seq id no.5所示的通用探针。
4、优选的，在每一条所述基因分型taqman探针的5’端标记有不同的荧光基团，3’端标记有不同的淬灭基团。
5、优选的，所述荧光基团选自texas red、6-fam或cy5；所述淬灭基团选自bhq2、mgb或bhq3。
6、本专利技术还提供了一种猪伪狂犬病毒基因i型的检测试剂盒，包括一对通用引物和基因分型taqman探针；所述基因分型taqman探针包括一种探针或两种探针，当为一种探针时，所述基因分型taqman探针为i型探针；当为两种探针时，所述基因分型taqman探针为i型探针和通用探针；
7、所述通用引物的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；
8、所述i型探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；
9、所述通用探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
10、本专利技术还提供了一种猪伪狂犬病毒基因ii型的检测试剂盒，包括一对通用引物和基因分型taqman探针；所述基因分型taqman探针包括一种探针或两种探针，当为一种探针时，所述基因分型taqman探针为ii型探针；当为两种探针时，所述基因分型taqman探针为ii型探针和通用探针；
11、所述通用引物的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；
12、所述ii型探针的核苷酸序列如seq id no.4所示；
13、所述通用探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
14、本专利技术还提供了一种猪伪狂犬病毒基因分型的试剂盒，包括一对通用引物和三条基因分型taqman探针，所述通用引物的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.2所示；
15、所述基因分型taqman探针包括：核苷酸序列如seq id no.3所示的i型探针、seqid no.4所示的ii型探针和seq id no.5所示的通用探针。
16、本专利技术还提供了一种单探针对猪伪狂犬病毒基因分型的方法，包括以目标基因组核酸为模板，与上述检测试剂盒中的通用引物和基因分型taqman探针混合配置荧光定量pcr分型检测体系，进行pcr反应后，根据扩增结果对猪伪狂犬病毒进行基因分型。
17、优选的，所述荧光定量pcr分型检测体系以20μl计，包括：2×aceq qpcr probemastermix 10μl，模板2μl，通用引物各0.9μl，基因分型taqman探针各0.4μl，和余量的ddh2o。
18、优选的，所述pcr反应的程序，包括：98℃5min；98℃10sec，60℃30sec，40个循环。
19、本专利技术还提供了一种多探针对猪伪狂犬病毒基因分型的方法，包括以目标基因组核酸为模板，与上述检测试剂盒中的通用引物和基因分型taqman探针混合配置荧光定量pcr分型检测体系，进行pcr反应后，根据扩增结果对猪伪狂犬病毒进行基因分型。
20、有益效果：本专利技术提供了一套猪伪狂犬病毒基因分型探针引物组，包括一对通用引物和基因分型taqman探针，所述基因分型探针引物组基于gn基因设计，其中prv基因i型标准曲线为y＝-3.492x+39.921(y：ct值，x：质粒拷贝数对数值)，相关系数r2＝0.9998。prv基因ii型标准曲线为y＝-3.5378x+44.095，相关系数r2＝0.9998。即本专利技术所述基因分型探针引物组在稀释度(101copies/μl～106copies/μl)范围内线性关系良好，最低检测限度均为101copies/μl，具有良好的灵敏性；与其他病毒不存在交叉反应，特异性良好；组内和组间各稀释度的变异系数均小于3％，重复性良好，因此，本专利技术所述基因分型探针引物组能够稳定地鉴定prv基因型。
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1.一套猪伪狂犬病毒基因分型探针引物组，其特征在于，包括一对通用引物和基因分型TaqMan探针，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.2所示；
2.根据权利要求1所述基因分型探针引物组，其特征在于，在每一条所述基因分型TaqMan探针的5’端标记有不同的荧光基团，3’端标记有不同的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述基因分型探针引物组，其特征在于，所述荧光基团选自TexasRed、6-FAM或CY5；所述淬灭基团选自BHQ2、MGB或BHQ3。
4.一种猪伪狂犬病毒基因I型的检测试剂盒，其特征在于，包括一对通用引物和基因分型TaqMan探针；所述基因分型TaqMan探针包括一种探针或两种探针，当为一种探针时，所述基因分型TaqMan探针为I型探针；当为两种探针时，所述基因分型TaqMan探针为I型探针和通用探针；
5.一种猪伪狂犬病毒基因II型的检测试剂盒，其特征在于，包括一对通用引物和基因分型TaqMan探针；所述基因分型TaqMan探针包括一种探针或两种探针，当为一种探针时，所述基因分型TaqMan探
6.一种猪伪狂犬病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，包括一对通用引物和三条基因分型TaqMan探针，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.2所示；
7.一种单探针对猪伪狂犬病毒基因分型的方法，其特征在于，包括以目标基因组核酸为模板，与权利要求4所述检测试剂盒或权利要求5中的通用引物和基因分型TaqMan探针混合配置荧光定量PCR分型检测体系，进行PCR反应后，根据扩增结果对猪伪狂犬病毒进行基因分型。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述荧光定量PCR分型检测体系以20μL计，包括：2×AceQ qPCRProbe MasterMix 10μL，模板2μL，通用引物各0.9μL，基因分型TaqMan探针各0.4μL，和余量的ddH2O。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR反应的程序，包括：98℃5min；98℃10sec，60℃30sec，40个循环。
10.一种多探针对猪伪狂犬病毒基因分型的方法，其特征在于，包括以目标基因组核酸为模板，与权利要求6所述试剂盒中的通用引物和基因分型TaqMan探针混合配置荧光定量PCR分型检测体系，进行PCR反应后，根据扩增结果对猪伪狂犬病毒进行基因分型。
...【技术特征摘要】
1.一套猪伪狂犬病毒基因分型探针引物组，其特征在于，包括一对通用引物和基因分型taqman探针，所述通用引物的核苷酸序列如seq id no.1～seq idno.2所示；
2.根据权利要求1所述基因分型探针引物组，其特征在于，在每一条所述基因分型taqman探针的5’端标记有不同的荧光基团，3’端标记有不同的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述基因分型探针引物组，其特征在于，所述荧光基团选自texasred、6-fam或cy5；所述淬灭基团选自bhq2、mgb或bhq3。
4.一种猪伪狂犬病毒基因i型的检测试剂盒，其特征在于，包括一对通用引物和基因分型taqman探针；所述基因分型taqman探针包括一种探针或两种探针，当为一种探针时，所述基因分型taqman探针为i型探针；当为两种探针时，所述基因分型taqman探针为i型探针和通用探针；
5.一种猪伪狂犬病毒基因ii型的检测试剂盒，其特征在于，包括一对通用引物和基因分型taqman探针；所述基因分型taqman探针包括一种探针或两种探针，当为一种探针时，所述基因分型taqman探针为ii型探针；当为两种探针时，所述基因分型taqman探针为ii型探针和通用探针；
6.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：金玉兰，季暄，董伟仁，颜焰，周继勇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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