一种固相核酸合成方法技术

本发明专利技术涉及核酸合成技术领域，本发明专利技术提供的一种固相核酸合成方法，采用固相亚磷酰胺法合成，包括合成反应循环步骤，每个合成反应循环包括去保护、偶联反应、加帽反应和氧化反应；所述偶联反应中，加入的核苷酸单体溶液终浓度为0.005‑0.025mol/L；本发明专利技术研究发现，通过控制加入的核苷酸单体浓度，在保证核酸合成质量的同时，有效降低DNA合成方法中核苷酸单体使用量，极大的降低了核酸合成成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸合成，具体涉及一种固相核酸合成方法。

技术介绍

1、目前，核酸高通量合成设备主要来源于进口，合成方案、合成试剂用量固定、单一，合成碱基成本较高，尤其是修饰探针、荧光标记核酸、rna及特殊结构的单体。核酸合成方法为固相亚磷酰胺法，其主要合成工艺为，一个合成循环(指的是一个碱基的延长)包括四个步骤，第一步是去保护，即用苯磺酸或三氯醋酸处理带有保护基的核苷，去除5'末端的二甲氧基三苯甲基(dmtr)，暴露出5'oh。第二步是偶联反应，加入经四唑激活的核苷，使其与前一个核苷的5'oh耦联。第三步是加帽反应，加入醋酐和二甲基氨基吡啶，使未参加反应的寡核苷酸链乙酰化，这样有利于纯化所需的全长dna片段。第四步是氧化反应，加入碘液等氧化试剂，使亚磷酸三酯转变为更稳定的磷酸三酯。完成一个合成循环后，载体上的每一个核苷酸链都会增长一个碱基，且始终被固定在固相载体上。过量的未反应物或分解物通过过滤或洗涤除去。当整个链达到预定长度后，从固相载体上切下并脱去保护基(氨解)，之后经过分离纯化得到所需的最终产物。上述柱法固相合成中，单体浓度默认为0.06-0.1m、本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种固相核酸合成方法，其特征在于，采用固相亚磷酰胺法合成，包括合成反应循环步骤，每个合成反应循环包括去保护、偶联反应、加帽反应和氧化反应；

2.根据权利要求1所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述偶联反应中，在加入核苷酸单体溶液的同时，还加入活化剂；所述活化剂为含ETT的浓度是0.25～0.6mol/L，BTT浓度是0.25～0.6mol/L，质量百分比0.1-1％氮甲基咪唑的溶液；

3.根据权利要求1或2所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述偶联反应的反应条件为：反应时间30s～2min，优选的40s。

4.根据权利要求1-3任一项所述的固相...

【技术特征摘要】

1.一种固相核酸合成方法，其特征在于，采用固相亚磷酰胺法合成，包括合成反应循环步骤，每个合成反应循环包括去保护、偶联反应、加帽反应和氧化反应；

2.根据权利要求1所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述偶联反应中，在加入核苷酸单体溶液的同时，还加入活化剂；所述活化剂为含ett的浓度是0.25～0.6mol/l，btt浓度是0.25～0.6mol/l，质量百分比0.1-1％氮甲基咪唑的溶液；

3.根据权利要求1或2所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述偶联反应的反应条件为：反应时间30s～2min，优选的40s。

4.根据权利要求1-3任一项所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述去保护步骤中，加入质量体积比为2.5-3.5％的dmt脱保护溶液3-8cv，反应20s-1min，重复该步骤1次；

5.根据权利要求1-4任一项所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述加帽反应中，加入capa溶液0.5-2cv和capb溶液0.5-2cv，反应10s-1min；所述capa溶液为含1-20v/v％醋酐的四氢呋喃溶液；所述capb溶液为四氢呋喃、吡啶和氮甲基咪唑按照体积比例64-84：1-20：6-26混合的溶液；

6.根据权利要求1-5任一项所述的固相核酸合成方法，其特征在于，所述氧化反应中，加入碘液1.5-4cv，反应10s-1min；所述碘液中碘的浓度为0.02-0.1mol/l，溶剂为吡啶、水和四氢呋喃按照体积比例15-25:5-15:65-75混合的溶液；

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【专利技术属性】
技术研发人员：陈园园，崔树琴，杜军，赵春德，王冰千，
申请(专利权)人：北京擎科生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：