【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分离纯化。具体涉及一种表面蛋白印迹聚合物的制备及应用。特别是一种依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法及在复杂生物样品中蛋白质的分离纯化方面的应用。
技术介绍
1、分子印迹技术(mips)是抗体与受体的关系，它具有定制的结合位点，与模板分子在形状，大小，以及官能团上互补。由于其独特的结构可预见性，识别的特异性，和通用性等特点，mips在各个领域内得到了广泛的应用。虽然分子印迹技术被广泛的应用，该技术被证明对于低分子量的分子量在1500以内的小分子蛋白特别有效，但是对于选择性识别蛋白质，病毒等大分子物质仍然具有很大的挑战，主要存在的难题是模板去除困难，印迹因子低下。
2、为了解决上述问题，研究者提出了表位印迹、表面印迹等印迹技术。其中表位印迹以大分子表面的某个肽段为模板进行印迹。然而，表位的寻找难度极大，且合成困难。不同的是，表面印迹技术以整个分子为模板，在纳米载体的表面形成薄的印迹聚合物层，可减少模板分子的传质阻力，有助于提高洗脱效率和印迹空腔的可及性。因此，表面印迹技术受到研究者的极大关注。
3、制备表面印迹聚合物的方法有溶胶-凝胶法、自氧化聚合法、表面接枝聚合法等。其中前两种方法依靠硅烷类单体的水解或者多巴胺的自氧化聚合，具有单体兼容性差的问题，难以与多种模板分子充分相互作用。而表面接枝聚合是在粒子表面修饰乙烯基基团，将其与各种含有乙烯基的单体进行自由基共聚合，可满足不同特性模板分子的需求，是制备表面印迹聚合物最常用的方法。然而，该方法要求低的单体浓度，这会导致较差的印迹效率。
4、fu等人在sio2纳米粒子表面修饰乙烯基，在单体和交联剂总浓度约0.4wt％条件下进行表面接枝聚合，获得的印迹聚合物的吸附容量仅为11.3mg g-1，印迹因子为1.23。li等人在单体和交联剂总浓度为0.6wt％的条件下，通过表面接枝聚合制备的表面印迹聚合物的吸附容量(约78.0mg g-1)有所提高，但印迹因子(1.69)依然较低。若提高单体浓度，会导致团聚甚至凝胶化问题。fu及jing等人在高单体浓度(约7wt％)的条件下通过传统表面接枝聚合法制备印迹聚合物，均发现了粒子聚集甚至凝胶化问题。因此，传统表面印迹聚合法在制备高印迹效率的印迹聚合物时，存在高单体浓度需求和凝胶化问题的矛盾。
技术实现思路
1、传统表面接枝聚合法在制备以蛋白质等大分子为模板的表面印迹聚合物时，为了避免团聚现象的发生，要求在低单体浓度条件下进行。然而低单体浓度会限制功能单体与模板分子的预组装，从而影响印迹聚合物的印迹效率。因此，本专利技术以酶级联反应介导局部自由基聚合实现在高单体浓度条件下制备表面印迹聚合物。具体来说，本专利技术利用由固定在纳米载体表面的葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶、乙酰丙酮和葡萄糖组成的引发体系启动局部自由基聚合反应，使聚合反应围绕纳米载体表面进行。本专利技术避免了自由基在整个溶液中的随机游离，即使在高单体浓度下聚合也不会出现团聚现象。同时，该方法在高单体浓度条件下进行，有利于功能单体和模板蛋白的充分预组装，从而可以提高印迹效率。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)将纳米粒子表面进行羧基化修饰：利用3-氨丙基三乙氧基硅烷在纳米粒子表面水解，洗涤后获得氨基化纳米粒子；
5、(2)将氨基化纳米粒子分散在四氢呋喃溶液中，加入丁二酸酐，室温搅拌1-8h后洗涤获得表面羧基化的纳米粒子；
6、(3)将洗涤后的羧基化纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液中，按照1.5：1的摩尔比加入葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)，随后在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺催化作用下使gox和hrp共价偶联在纳米粒子表面；
7、(4)用去离子水洗涤步骤(3)中的产物，获得固定化酶的纳米离子分散液；
8、(5)将模板蛋白、主单体、功能单体、交联剂加入ph 5.0磷酸盐缓冲液，预组装10-60min，获得预组装液；
9、(6)向步骤(5)预组装液中加入固定化酶的纳米粒子分散液、乙酰丙酮和葡萄糖，引发聚合反应；在室温条件下聚合4-8h后停止反应，获得聚合液；
10、(7)将步骤(6)中的聚合液离心并洗涤3-6次，获得表面蛋白印迹聚合物。
11、所述的纳米粒子包括sio2、fe3o4、fe3o4-cu、mof、cof、au、ceo2或ag。
12、所述的步骤(1)中3-氨丙基三乙氧基硅烷浓度为0.01-0.20m。
13、所述的步骤(2)中氨基化纳米粒子分散在四氢呋喃溶液中粒子浓度为0.01-0.10mg ml-1，加入丁二酸酐浓度为0.01-0.20m。
14、所述的步骤(3)中将洗涤后的羧基化纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液中粒子浓度为0.01-0.10mg ml-1，按照1.5：1的摩尔比加入葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺浓度为0.05-1.0m。
15、所述的步骤(4)中获得固定化酶的纳米离子分散液粒子浓度为0.01-0.10mg ml-1。
16、所述的步骤(5)中模板蛋白浓度0.01-0.10mm、主单体浓度0.05-1.00m、功能单体浓度1.74-34.80mm、甲基丙烯酸浓度1.74-34.80mm、交联剂浓度0.67-13.35mm；预组装液中模板蛋白为溶菌酶、牛血清白蛋白、细胞色素c、牛血红蛋白、人免疫球蛋白、淀粉样蛋白等各种酸性、中性及碱性蛋白；主单体包括n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺；功能单体包括甲基丙烯酸、丙烯酰胺、苯乙烯、n-叔丁基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酸二甲氨乙酯；交联剂为n,n-亚甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚谷氨酸多肽交联剂。
17、所述的步骤(6)预组装液中加入固定化酶的纳米粒子分散液为4.0ml,0.01-0.10mg ml-1、乙酰丙酮浓度0.05-0.20m、葡萄糖浓度0.05-0.20m。
18、本专利技术方法制备的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物应用于复杂生物样品中蛋白质的提取和纯化。
19、所述的复杂生物样品包括鸡蛋清等。
20、本专利技术中表面蛋白印迹聚合物的印迹效率测试采用文献报道的常用方法进行，具体如下：
21、(1)将采用本专利技术合成方法制备的表面蛋白印迹聚合物(mip)和相对应得非印迹聚合物(nip)真空干燥。
22、(2)称取步骤(1)中干燥的mip和相对应的nip约10mg于离心管(各6个)，加入ph5.0磷酸缓冲液(8ml)充分溶胀，使其达到溶胀平衡后去除溶液。
23、(3)配置1.0mg ml-1的溶菌酶母液，梯度稀释为初始浓度(c0)分别为0.1、0.2、0.4、
24、0.6、0.8和1.0的溶菌酶溶液。
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【技术保护点】
1.一种依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，纳米粒子包括SiO2、Fe3O4、Fe3O4-Cu、MOF、COF、Au、CeO2或Ag。
3.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(1)中3-氨丙基三乙氧基硅烷浓度为0.01-0.20M。
4.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(2)中氨基化纳米粒子分散在四氢呋喃溶液中粒子浓度为0.01-0.10mg mL-1，加入丁二酸酐浓度为0.01-0.20M。
5.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(3)中将洗涤后的羧基化纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液中粒子浓度为0.01-0.10mgmL-1，按照1.5：1的摩尔比加入葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺浓度为0.05-1.0M。
6.如权利
7.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(5)中模板蛋白浓度0.01-0.10mM、主单体浓度0.05-1.00M、功能单体浓度1.74-34.80mM、甲基丙烯酸浓度1.74-34.80mM、交联剂浓度0.67-13.35mM；预组装液中模板蛋白为溶菌酶、牛血清白蛋白、细胞色素C、牛血红蛋白、人免疫球蛋白、淀粉样蛋白等各种酸性、中性及碱性蛋白；主单体包括N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺；功能单体包括甲基丙烯酸、丙烯酰胺、苯乙烯、N-叔丁基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酸二甲氨乙酯；交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚谷氨酸多肽交联剂。
8.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(6)预组装液中加入固定化酶的纳米粒子分散液为4.0mL,0.01-0.10mg mL-1、乙酰丙酮浓度0.05-0.20M、葡萄糖浓度0.05-0.20M。
9.权利要求1方法制备的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物应用于复杂生物样品中蛋白质的提取和纯化。
...【技术特征摘要】
1.一种依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，纳米粒子包括sio2、fe3o4、fe3o4-cu、mof、cof、au、ceo2或ag。
3.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(1)中3-氨丙基三乙氧基硅烷浓度为0.01-0.20m。
4.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(2)中氨基化纳米粒子分散在四氢呋喃溶液中粒子浓度为0.01-0.10mg ml-1，加入丁二酸酐浓度为0.01-0.20m。
5.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(3)中将洗涤后的羧基化纳米粒子分散在磷酸盐缓冲液中粒子浓度为0.01-0.10mgml-1，按照1.5：1的摩尔比加入葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺浓度为0.05-1.0m。
6.如权利要求1所述的依靠酶级联反应的表面蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤(4)中...
【专利技术属性】
技术研发人员：张拥军，王亚斐，张岩，
申请(专利权)人：沧州市天津工业大学研究院，
类型：发明
国别省市：
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