【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开一般涉及用于生产处于其天然构象的功能性重组蛋白的方法。本专利技术特别可用于生产有利于翻译后修饰诸如修剪、正确折叠和糖基化的蛋白质。
技术介绍
1、胰岛素是一种重要的多肽激素，由朗格汉斯岛(islet of langerhans)的胰腺β细胞产生，是维持哺乳动物(包括人类)和其他脊椎动物血糖稳态所必需的。在健康个体中，血糖水平的升高会刺激胰腺的β细胞分泌胰岛素。然后，胰岛素多肽与肌肉、肝脏和脂肪组织中的特定受体结合，导致这些靶组织对葡萄糖的摄取增加、代谢增加以及肝葡萄糖的产生减少。这些反应的累积效应使血糖浓度保持在恒定水平。
2、全球约有1.77亿人患有糖尿病。其中包括约1700万i型糖尿病患者，对于他们来说，补充缺少的内分泌胰岛素分泌是目前唯一可能的疗法，否则会出现酮症酸中毒等并发症、昏迷以及数周内的死亡。使用次优剂量的胰岛素治疗的i型糖尿病患者会出现继发性疾病诸如酮症酸中毒、失明、心脏病和肾衰竭。尽管在移植和细胞疗法方面取得了巨大进步，但仍然无法治愈1型糖尿病。ii型糖尿病与i型糖尿病不同之处在于，ii型糖尿病相对而...
【技术保护点】
1.一种用于在感受态宿主细胞中使用修饰的人胰岛素原多肽生产处于其天然构象的功能性重组蛋白(包含胰岛素类似物和/或其衍生物)的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中包含编码所述修饰的人胰岛素原多肽的所述异源核酸的表达载体还包含编码用于将所述修饰的胰岛素原多肽加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的异源核酸序列。
3.如权利要求2所述的方法，其中用于将所述修饰的胰岛素原多肽加工成功能性胰岛素的所述一种或多种剂选自内切蛋白酶和羧肽酶。
4.如权利要求1所述的方法，其还包括用包含编码用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于在感受态宿主细胞中使用修饰的人胰岛素原多肽生产处于其天然构象的功能性重组蛋白(包含胰岛素类似物和/或其衍生物)的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中包含编码所述修饰的人胰岛素原多肽的所述异源核酸的表达载体还包含编码用于将所述修饰的胰岛素原多肽加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的异源核酸序列。
3.如权利要求2所述的方法，其中用于将所述修饰的胰岛素原多肽加工成功能性胰岛素的所述一种或多种剂选自内切蛋白酶和羧肽酶。
4.如权利要求1所述的方法，其还包括用包含编码用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的异源核酸序列的第二表达载体共转化所述感受态宿主细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的所述一种或多种剂选自内切蛋白酶和羧肽酶。
6.如权利要求3或5所述的方法，其中所述内切蛋白酶选自包含激素原转化酶1/3(pc1/3)和激素原转化酶2(pc2)的组。
7.如权利要求3或5所述的方法，其中编码用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的所述异源核酸序列编码seq id no:5的所述序列。
8.如权利要求3或5所述的方法，其中编码用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的所述异源核酸序列编码seq id no:6的所述序列。
9.如权利要求3或5所述的方法，其中所述羧肽酶是羧肽酶e(cpe)。
10.如权利要求3或5所述的方法，其中编码用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的所述异源核酸序列编码seq id no:7或8的所述序列。
11.如权利要求2或4所述的方法，其中编码所述修饰的人胰岛素原多肽的所述异源核苷酸序列编码seq id:no.1的所述序列；并且其中用于将所述修饰的人胰岛素原多肽加工成功能性胰岛素的一种或多种剂包含pc1/3和cpe以及任选的pc2。
12.如权利要求11所述的方法，其中编码用于将所述修饰的人胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的所述异源核酸序列编码seq id no:5和seq id no:7或8以及任选的seq id no:6的所述序列。
13.如权利要求2或4所述的方法，其中编码所述修饰的人胰岛素原多肽的所述异源核苷酸序列编码seq id:no.3的所述序列；并且其中用于将所述修饰的人胰岛素原多肽加工成功能性胰岛素的一种或多种剂包含pc1/3以及任选的pc2。
14.如权利要求13所述的方法，其中编码用于将所述修饰的人胰岛素原加工成功能性胰岛素的一种或多种剂的所述异源核酸序列编码和seq id no:5以及任选的seq id no:6的所述序列。
15.如权利要求13所述的方法，其还包括阻断所述感受态宿主细胞中内源性羧肽酶e活性的所述步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述阻断步骤包括通过基于crispr的同源重组将缺失或突变引入所述感受态宿主细胞中seq id no:9的所述序列的位置202的内源cpe中。
17.如权利要求16所述的方法，其中seq id no:9的所述序列的位置202的所述突变为s202p突变。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述阻断步骤包括在所述感受态宿主细胞中共表达突变的cpe，所述突变的cpe在选自包含seq id no:9的所述序列的72h、75e、147r、192h、202s、243y和296e的组的位置具有至少一个突变。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述阻断步骤包括添加阻断剂，所述阻断剂选自包含多巴胺奎宁、多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、马铃薯羧肽酶抑制剂(pci)、9聚体肽指定的cpi-2kr，以及编码诱饵精氨酸序列的肽的组。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述表达载体选自慢病毒载体系统。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述感受态宿主细胞是选自包含hek293细胞、cho细胞、cos和hela细胞的组中的哺乳动物细胞。
22.如权利要求1-14和20中任一项所述的方法，其中所述感受态宿主细胞选自包含藻类和酵母的组。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述感受态宿主细胞包含遗传修饰以促进所述细胞质内形成用于将所述修饰的胰岛素原加工成功能性胰岛素的稳定二硫键。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中收获所述胰岛素类似物和/或其衍生物的所述步骤包括从所述转化的哺乳动物细胞中分离所述胰岛素。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述胰岛素类似物和/或其衍生物是连续生产的。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述胰岛素类似物和/或其衍生物可有效治疗糖尿病、糖尿病前期和高血糖症。
27.多核苷酸编码
28.如权利要求27所述的多核苷酸，其中用于将所述修饰的人胰岛素原加工成功能性胰岛素的所述至少一种剂选自包含内切蛋白酶和羧肽酶的组。
29.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述内切蛋白酶选自包含pc1/3和pc2的组。
30.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述pc1/3由seq id no:5的所述序列编码。
31.如权利要求29所述的多核苷酸，其中所述内切蛋白酶是pc2。
32.如权利要求31所述的多核苷酸，其中所述pc2由seq id no:6的所述序列编码。
33.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述羧肽酶是cpe。
34.如权利要求33所述的多核苷酸，其中所述cpe由seq id no:7或8的所述序列编码。<...
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