【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及类器官模型，具体地，本专利技术涉及一种高通量类器官的构建方法，更具体地，本专利技术涉及一种高通量骨骼肌类器官的构建方法。
技术介绍
1、类器官技术是一种利用哺乳动物多能干细胞或成体组织来源的干细胞自我组织的特性在体外构建3d类似体内的微环境的具有多细胞类型的细胞团块。近年来已有多种组织器官的类器官研究报道，这些具有多细胞类型复杂程度的类器官已经与对应体内组织器官高度类似。这种技术为研究组织器官的发育，再生及病理提供了理想的平台。
2、骨骼肌类器官是一种理想的药物筛选模型，关于骨骼肌类器官的构建，专利cn108660107a公开了一种骨骼肌类器官构建方法，该方法包括：从小鼠骨骼肌中分离的成肌祖细胞(mpcs)与其骨骼肌中的快速贴壁细胞(racs)在martrigel中3d共培养并经分化诱导后得到可以抽动的类肌肉组织块的步骤。方法简易，可操作性强。但该技术中小鼠骨骼肌类器官技术平台由于受到matrigel成胶时间长，有些步骤需要手工完成等在一定程度上限制了骨骼肌类器官高通量生产。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题，为此，本专利技术提供了一种高通量骨骼肌类器官构建方法。
2、本专利技术采用的技术方案为：
3、第一方面，
4、本专利技术提供了一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，包括如下步骤：
5、(1)将从骨骼肌中分离的成肌祖细胞(mpcs)和快速贴壁细胞(racs)与matri
6、(2)将matrigel细胞悬液加入到4～6％(w/v)海藻酸钠溶液中，得到海藻酸钙胶囊包被的matrigel细胞球(骨骼肌类器官前体)；
7、(3)将海藻酸钙胶囊包被的matrigel细胞球置于培养箱中使matrigel凝固成胶，成胶后将海藻酸钙胶囊包被的matrigel细胞球再置于生长培养基中培养1天(以脱除海藻酸钙胶囊)；
8、(4)将matrigel细胞混合物从生长培养基转移至分化培养基中诱导成肌分化至有收缩功能的骨骼肌类器官。
9、本专利技术方法将混有cacl2的matrigel细胞悬液(mpcs、racs)滴至海藻酸钠溶液中，之后ca2+与海藻酸钠结合在matrigel细胞悬液的表面形成一层海藻酸钙胶囊以阻止未成胶的matrigel细胞悬液溶解扩散，形成外层由海藻酸钙胶囊包被内层matrigel细胞球的结构，以此达到快速匀质制造matrigel细胞球的目的；然后将海藻酸钙胶囊包被的matrigel细胞球(类器官前体)置于37℃细胞培养箱中放置使matrigel凝固成胶，待matrigel成胶后将海藻酸钙胶囊包被的matrigel细胞胶球置于生长培养基中培养1天，培养过程中，生长培养基中的磷酸根溶解掉海藻酸钙胶囊壳，进而释放出matrigel细胞球，可以继续在生长培养基中进行扩增培养，最后在分化培养基中培养5-7天得到骨骼肌类器官。本专利技术方法简易，可操作性强，且短时间内(5min)可以得到大量(>100个)骨骼肌类器官前体，经诱导分化培养后得到大量骨骼肌类器官，适用于高通量药筛研究。
10、在一些实施例中，所述骨骼肌来源为人源或者非人哺乳动物来源。在一个具体的实施例中，所述骨骼肌来源为人或小鼠。
11、在一些优选地实施例中，步骤(1)中，形成的matrigel细胞悬液的cacl2浓度为1％(w/v)。
12、在一些实施例中，步骤(1)为：将racs和mpcs体外扩增到3～4代；用胰酶分别将racs和mpcs消化成细胞悬液并分别计数；取所需细胞悬液，将racs和mpcs按(1～2):(1～2)的个数比混合，离心去上清；用4％(w/v)浓度cacl2溶液与生长培养基按体积比1:1比例混匀得到a液(冰上预冷)，然后将a液(冰上预冷后)与matrigel原液在冰上按体积比1:1比例混匀得到b液，用b液重悬细胞混匀即得到1％(w/v)cacl2的matrigel细胞悬液，之后放冰上备用。
13、作为一个优选示例，步骤(1)中，racs和mpcs的个数比为1:1。
14、在一些实施例中，步骤(2)中海藻酸钠溶液的浓度为5％(w/v)。
15、在一些实施例中，所述生长培养基的组成为：h-dmem，5-20％fbs(胎牛血清)，0.5-1.5％ps(青-链霉素)，5-50ng/ml bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)。优选地，所述生长培养基的组成为：h-dmem，10％fbs，1％ps，10ng/ml bfgf。
16、在一些实施例中，所述分化诱导培养基的组成为：h-dmem，1～3％hs(马血清)，100～200u/ml青霉素，100～200u/ml链霉素。优选地，所述分化诱导培养基的组成为：h-dmem，2％hs，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素。
17、在一些实施例中，步骤(3)中，将海藻酸钙胶囊包被的matrigel细胞球置于37℃的co2培养箱中15～40min使matrigel凝固成胶。
18、在一些实施例中，步骤(4)中，分化培养基中的培养时间为5～7天。进一步地，分化培养基24h换液一次。可以看出，本专利技术方法下，matrigel细胞球置于分化培养基中培养5～7天就可以诱导成肌分化至有收缩功能的骨骼肌类器官。相比于现有技术，本专利技术方法大大缩短了骨骼肌类器官的构建周期。
19、在一些实施例中，所述成肌祖细胞(mpcs)和快速贴壁细胞(racs)由包括如下步骤的方法制备得到：
20、1)将剃除肌腱，脂肪和筋膜的肌肉组织剪成肉浆；离心，去上清；用hbss洗涤并再次离心；
21、2)去上清，加37℃预热后的0.2％胶原酶ⅺ重悬肌肉开始消化，37℃水浴锅中孵1小时，其中每10min颠倒混匀一次；
22、3)肉浆-酶混合物离心去上清后，用dispase溶液重悬，37℃水浴锅中孵1小时；
23、4)肉浆-酶混合物离心，去上清后用0.1％胰酶重悬，37℃水浴锅中孵45min；
24、5)离心，去上清后用gm重悬；
25、6)用70μm孔径细胞筛过滤重悬物；
26、7)用注射器抽吸重悬液；
27、8)将重悬液转移到胶原ⅰ包被后的培养皿中，命名为pp1；
28、9)37℃细胞培养箱中放置2h后将上清转移至新的胶原ⅰ包被60mm培养皿中并命名为pp2，在pp1中加入新鲜生长培养基(growth medium,gm)；
29、10)24h后将pp2中的上清转移至新的胶原ⅰ包被培养皿中并命名为pp3，在pp2中加入新鲜生长培养基；
30、11)重复步骤10)直到获得pp6，上清在pp6培养皿中72h后再吸弃换新的培养基；
31、pp1,pp2中的细胞为快速本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
8.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
9.一种骨骼肌类器官，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的骨骼肌类器官，所述骨骼肌类器官直径为1.5～2mm；
10.权利要求9所述骨骼肌类器官的应用，所述骨骼肌类器官用于体外模拟损伤再生研究，用于筛选诱导或促进损伤再生的治疗化合物，或用作重建损伤相关再生过程的体外模型的用途；
【技术特征摘要】
1.一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的一种高通量骨骼肌类器官的构建方法，其特征在于，
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳宏伟，刘怡孝，邹晓晖，李丽颖，
申请(专利权)人：良渚实验室，
类型：发明
国别省市：
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