一种绿潮暴发预警的分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种绿潮暴发预警的分子检测方法，基于绿潮暴发早期四种石莼属绿潮藻非核基因组高度保守区开发引物并利用绝对定量PCR技术确定绿潮藻基因组DNA浓度与Ct值的关系，实现快速定量海水中的绿潮藻。对含有绿潮藻的海水可进行分子检测，实现快速定量海水中的绿潮藻，包括如下步骤：S1.引物设计；S2.样品采集和保存；S3.基因组DNA提取；S4.DNA浓度检测及质量控制；S5.制备DNA浓度梯度标准品；S6.PCR扩增；S7.绝对定量PCR检测等。本发明专利技术创新性地运用先进的分子技术，在绿潮暴发初期，对海水样本进行分子检测，实现了对海水中绿潮藻含量的快速分析，有效提升了绿潮预警与监测的效率与准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及绿潮预警研究，属于一种针对绿潮暴发的生态灾害预警的分子检测方法。

技术介绍

1、自2007年以来，绿潮已连续18年在黄海大规模暴发，成为我国海域主要海洋生态灾害之一。目前研究表明，我国黄海绿潮暴发早期存在四种漂浮绿潮藻，分别是石莼属的浒苔(ulva prolifera)、缘管浒苔(u.linza)、曲浒苔(u.flexuosa)和扁浒苔(u.compressa)。因此，掌握这四种石莼属绿潮藻的增长情况，就能有效监视监测绿潮暴发的情况。

2、绿潮的监测和防治是一个复杂的问题，现阶段绿潮暴发的监视监测手段主要为卫星遥感监测、无人机监测、船舶和陆岸巡视监测、生态浮标监测等。使用遥感和无人机监测，当发现绿潮时通常已是暴发状态，无法起到预警的效果。船舶和陆岸巡视监测通常耗费大量人力物力财力，船舶和人只能到达部分区域，没有到达的区域往往难以发现绿潮，还须结合遥感和无人机，所以发现时也为时已晚，一旦发现一般已进入需打捞阶段。生态浮标监测通常范围有限，只能在放置浮标点位的周围进行监测，体现在覆盖范围不足、预警准确性不高、反应速度滞后等缺点。目前缺本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，基于引起绿潮暴发的四种石莼属绿潮藻的非核基因组开发引物，并利用绝对定量PCR技术确定绿潮藻基因组DNA浓度与Ct值的关系，实现速定量海水中的绿潮藻，在绿潮暴发早期，对含有绿潮藻的海水可进行分子检测，实现快速定量海水中的绿潮藻，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，所述步骤S1中基于四种石莼属(U.flexuosa、U.linza、U.prolifera、U.compressa)线粒体和叶绿体基因组的高度保守区域，设计引物(上游引物F：GGGCCGTCGCTCAACGGATAA；下...

【技术特征摘要】

1.一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，基于引起绿潮暴发的四种石莼属绿潮藻的非核基因组开发引物，并利用绝对定量pcr技术确定绿潮藻基因组dna浓度与ct值的关系，实现速定量海水中的绿潮藻，在绿潮暴发早期，对含有绿潮藻的海水可进行分子检测，实现快速定量海水中的绿潮藻，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，所述步骤s1中基于四种石莼属(u.flexuosa、u.linza、u.prolifera、u.compressa)线粒体和叶绿体基因组的高度保守区域，设计引物(上游引物f：gggccgtcgctcaacggataa；下游引物r：atatggaccgaactgtctcg)，所述步骤s1中下载四种石莼属绿潮藻(u.flexuosa、u.linza、u.prolifera、u.compressa)的线粒体和叶绿体基因组序列，对下载得到的线粒体和叶绿体基因组序列集分别利用本地blast鉴定上述四种石莼属绿潮藻的高度保守区域，鉴定标准为identify＝100％，gap<2，length<10000，最终选择叶绿体基因组进行下一步研发，利用primer premier 5对保守区域设计引物(上游向引物f：gggccgtcgctcaacggataa；下游引物r：atatggaccgaactgtctcg)。

3.根据权利要求1所述的一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，所述步骤s2中按照水样采集的方式进行绿潮样品采集，使用无人船，可达到多点位、大范围的效果，可根据季节预估绿潮藻含量情况决定水样采集量，含有绿潮藻的水样样品保存在4℃下，在10天内完成dna提取。

4.根据权利要求1所述的一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，所述步骤s3中将样品离心并记录水样体积(v)，使海水与藻体分离，记录藻体湿重(w)。水样量较大的样品，则过滤后再进行离心。离心得到的样品经液氮研磨后，使用《genomic dnapurification kit(t3010，neb)dna提取试剂盒》提取绿潮藻dna，理论上也可使用其他针对植物的dna提取试剂盒。提取基因组dna共6次，便于后续分析绿潮藻湿重与基因组dna浓度的关系。

5.根据权利要求1所述的一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，所述步骤s4中用微量分光光度仪检测并记录dna提取液的a260/a280、a260/230值，计算dna浓度。a260/a280≥1.70，表明提取的基因组dna纯度较好，a260/230≥1.80，证明提取的基因组dna污染较少，满足以上2个条件的方可进行下一步检测。

6.根据权利要求1所述的一种绿潮暴发预警的分子检测方法，其特征在于，所述步骤s5中将步骤s3所得的基因组dna按比例稀释得到7个梯度的基因组dna溶液100、10-1、10-2、10-3、10-4、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁一鸣，郑华军，王肖波，贺滢，张亭亭，邓邦平，邵力，姚炜民，
申请(专利权)人：国家海洋局东海环境监测中心国家海洋局东海海洋工程勘察设计研究所，
类型：发明
国别省市：