【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法及其在横纹肌溶解相关急性肾损伤中的应用。
技术介绍
1、急性肾损伤(aki)是横纹肌溶解症(rm)的重要并发症。当横纹肌细胞因挤压、缺血等原因而被破坏，一些细胞内容物如肌红蛋白(mb)、钾离子等进入血液循环中。继而引起以肌红蛋白血症、肌红蛋白尿、高钾血症、代谢性酸中毒和急性肾损伤甚至多器官功能障碍为特点的临床综合征。约10-60％的rm患者因高肌红蛋白血症导致急性肾损伤。目前没有确实有效治疗横纹肌溶解相关急性肾损伤(rm-aki)的靶向药物，患者预后较差。
2、触珠蛋白(hp)属于急性期血浆蛋白家族，几乎只在肝脏中合成，在应激反应中迅速上调。在rm-aki期间的肾皮质中，hp基因快速、显着和持续性的表达，并且可能通过抗氧化与调节炎症反应影响急性肾损伤的发病机制和/或结果。损伤严重时会导致hp蛋白耗竭，从而危害机体健康。此外，hp最初被发现作为血红蛋白最重要的血浆解毒剂。以人类血液为来源的hp蛋白静脉注射制剂已在日本获批上市，用于治疗与溶血反应相关的血红蛋白血症和血红蛋白尿症。鉴于mb与血红蛋白α亚基在结构上的同源性，推测血红蛋白α亚基的结合位点，即触珠蛋白β亚基(hpβ)蛋白，能够特异性地结合mb。然而，hpβ蛋白能否通过与急性肾损伤期间损伤相关因子相互作用发挥潜在的治疗作用仍有待进一步探讨。此外，市面上销售的hp蛋白的主要来源是珍贵的人源血浆，不易于大量获得和投入研究。
3、申请公布号为cn110724185a的专利技术专利公开了重组人
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种重组人触珠蛋白β亚基基因，该人触珠蛋白β亚基基因经密码子优化并引进gst标签，可以简单快速地制备重组人触珠蛋白β亚基蛋白，且得到的重组人触珠蛋白β亚基蛋白可直接用于体外gstpulldown实验，应用范围广，有助于进一步研究人触珠蛋白β亚基蛋白结合和清除血清肌红蛋白的能力。
2、本专利技术的第二个目的是提供一种重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，从而优化人触珠蛋白β亚基蛋白表达水平。
3、本专利技术的第三个目的是提供一种重组人触珠蛋白在横纹肌溶解相关急性肾损伤药物治疗中的应用。
4、为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为：一种重组人触珠蛋白β亚基基因，所述重组人触珠蛋白β亚基基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、一种如上述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，包括以下步骤：将人触珠蛋白β亚基基因片段以宿主细胞表达系统的密码子偏好性为基准进行核苷酸序列优化，将优化后的人触珠蛋白β亚基基因插入原核表达载体pgex-6p-1，构建重组表达载体pgex-6p-1-hpβ，将pgex-6p-1-hpβ转化到宿主细胞感受态细胞c，获得重组人触珠蛋白β亚基工程菌株c-pgex-6p-1-hpβ，将c-pgex-6p-1-hpβ进行培养，然后加入iptg诱导表达重组人gst-hpβ蛋白包涵体；将得到的重组人gst-hpβ蛋白包涵体进行纯化，即得。
6、进一步的，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：将优化后的人触珠蛋白β亚基基因命名为opt-hpβ基因；设计pcr引物，正向引物序列为5’-ccggaattccgtattctgggtggtcatc-3’，反向引物序列为5’-gtgctcgagttaattttctgcaatggttttc-3；使用所述pcr引物对所述opt-hpβ基因进行pcr扩增，将opt-hpβ基因的扩增产物用eori/xhoi进行双酶切处理，将双酶切后含有opt-hpβ基因的基因片段回收；用ecori和xhoi对原核表达载体pgex-6p-1进行双酶切处理，然后将双酶切后含有原核表达载体pgex-6p-1的载体片段回收；将回收的载体片段与基因片段进行连接反应后，转化到感受态细胞c，获得工程菌株pgex-6p-1-hpβ。
7、进一步的，所述c-pgex-6p-1-hpβ的培养方法包括以下步骤：挑取工程菌株c-pgex-6p-1-hpβ单菌落接种于lb培养基中，摇床振荡培养过夜；将过夜培养的c-pgex-6p-1-hpβ的菌液接种到lb培养基中，培养至c-pgex-6p-1-hpβ菌液的od600达到0.4～0.6时，加入iptg诱导表达重组人gst-hpβ蛋白包涵体。
8、进一步的，所述重组人gst-hpβ蛋白包涵体的纯化包括以下步骤：诱导表达重组人gst-hpβ蛋白包涵体，将诱导表达结束后的培养液离心，收集下层菌体沉淀，重选菌体，冰浴超声破碎菌体，离心后用人gst-hpβ蛋白包涵体洗涤缓冲液洗涤菌体沉淀，用人gst-hpβ蛋白包涵体溶解缓冲液使菌体沉淀变性溶解；将含有重组人gst-hpβ蛋白包涵体的变性后溶液用透析缓冲液进行透析复性；将含有重组人gst-hpβ蛋白包涵体的复性后溶液负载到gst标签蛋白琼脂糖纯化柱上，用15倍柱体积的洗杂缓冲液洗纯化柱，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用10kda超滤管浓缩并更换为pbs溶液。
9、进一步的，所述宿主细胞感受态细胞c包括但不限于大肠杆菌bl21(de3)、shufflet7-b。
10、如上述方法获得的重组人触珠蛋白在横纹肌溶解相关急性肾损伤药物治疗中的应用。
11、本专利技术的有益效果：
12、本专利技术针对重组人触珠蛋白β亚基在原核细胞表达系统中的表达难点，采用密码子优化技术，构建可在原核细胞表达系统中高效表达的细胞株，为触珠蛋白β亚基蛋白的产率提供了保障。
13、本专利技术构建带有gst标签的重组人触珠蛋白β亚基的原核表达载体，通过转化大肠杆菌bl21(de3)菌株，获得重组蛋白表达的工程菌，进而获得重组蛋白的表达，纯化得到的重组人触珠蛋白β亚基蛋白可直接用于体外gstpulldown实验。
14、本专利技术提供一种蛋白产率高及操作简便的人触珠蛋白β基因原核表达载体构建方法，可以简单快速地制备重组人触珠蛋白β亚基蛋白，规避人源血浆的问题，并且复配相应的缓冲体系和纯化策略，为人触珠蛋白β亚基蛋白的产量、纯度和活力提供了技术保障。
15、本专利技术中带有gst标签的重组人触珠蛋白β亚基蛋白能够特异性地结合肌红蛋白，对横纹肌溶解相关急性肾损伤小鼠发挥治疗作用。此外，重组人触珠蛋白β亚基蛋白还可能通过与急性肾损伤期间其他损伤相关因子相互作用发挥本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组人触珠蛋白β亚基基因，其特征在于，所述重组人触珠蛋白β亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将人触珠蛋白β亚基基因片段以宿主细胞表达系统的密码子偏好性为基准进行核苷酸序列优化，将优化后的人触珠蛋白β亚基基因插入原核表达载体pGEX-6P-1，构建重组表达载体pGEX-6P-1-Hpβ，将pGEX-6P-1-Hpβ转化为宿主细胞感受态细胞C，获得重组人触珠蛋白β亚基工程菌株C-pGEX-6P-1-Hpβ，将C-pGEX-6P-1-Hpβ进行培养，然后加入IPTG进行诱导表达重组人GST-Hpβ蛋白包涵体；将得到的重组人GST-Hpβ蛋白包涵体进行纯化，即得。
3.根据权利要求2所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：将优化后的人触珠蛋白β亚基基因命名为OPT-Hpβ基因；设计PCR引物，正向引物序列为5’-CCGGAATTCCGTATTCTGGGTGGTCATC-3’，反向引物序列为5’-GTGC
4.根据权利要求2所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，所述C-pGEX-6P-1-Hpβ的培养方法包括以下步骤：挑取工程菌株C-pGEX-6P-1-Hpβ单菌落接种于LB培养基中，摇床振荡培养过夜；将过夜培养的C-pGEX-6P-1-Hpβ的菌液接种到LB培养基中，培养至C-pGEX-6P-1-Hpβ菌液的OD600达到0.4～0.6时，加入IPTG诱导表达重组人GST-Hpβ蛋白包涵体。
5.根据权利要求2所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，所述重组人GST-Hpβ蛋白包涵体的纯化包括以下步骤：诱导表达重组人GST-Hpβ蛋白包涵体，将诱导表达结束后的培养液离心，收集下层菌体沉淀。重悬菌体，冰浴超声破碎菌体，离心后用人GST-Hpβ蛋白包涵体洗涤缓冲液洗涤菌体沉淀，用人GST-Hpβ蛋白包涵体溶解缓冲液使菌体沉淀变形溶解；将含有重组人GST-Hpβ蛋白包涵体的变性后溶液用透析缓冲液进行透析复性；将含有重组人GST-Hpβ蛋白包涵体的复性后溶液负载到GST标签蛋白琼脂糖纯化柱上，用15倍柱体积的洗杂缓冲液洗纯化柱，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用10KDa超滤管浓缩并更换为PBS溶液。
6.根据权利要求2所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，所述宿主细胞感受态细胞C包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)、ShuffleT7-B。
7.如权利要求2所述的方法获得的重组人触珠蛋白在横纹肌溶解相关急性肾损伤药物治疗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组人触珠蛋白β亚基基因，其特征在于，所述重组人触珠蛋白β亚基基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将人触珠蛋白β亚基基因片段以宿主细胞表达系统的密码子偏好性为基准进行核苷酸序列优化，将优化后的人触珠蛋白β亚基基因插入原核表达载体pgex-6p-1，构建重组表达载体pgex-6p-1-hpβ，将pgex-6p-1-hpβ转化为宿主细胞感受态细胞c，获得重组人触珠蛋白β亚基工程菌株c-pgex-6p-1-hpβ，将c-pgex-6p-1-hpβ进行培养，然后加入iptg进行诱导表达重组人gst-hpβ蛋白包涵体；将得到的重组人gst-hpβ蛋白包涵体进行纯化，即得。
3.根据权利要求2所述的重组人触珠蛋白β亚基表达纯化方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：将优化后的人触珠蛋白β亚基基因命名为opt-hpβ基因；设计pcr引物，正向引物序列为5’-ccggaattccgtattctgggtggtcatc-3’，反向引物序列为5’-gtgctcgagttaattttctgcaatggttttc-3；使用所述pcr引物对所述opt-hpβ基因进行pcr扩增，将opt-hpβ基因的扩增产物用eori/xhoi进行双酶切处理，将双酶切后的含有opt-hpβ基因的基因片段回收；用ecori和xhoi对原核表达载体pgex-6p-1进行双酶切处理，然后将双酶切后的含有原核表达载体pgex-6p-1的载体片段回收；将回收的载体片段与基因片段进行连接反应后...
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