检测蓖麻毒素的方法技术

本发明专利技术建立了一种检测蓖麻毒素的新方法。该方法包括：利用偶联有抗蓖麻毒素单克隆抗体（６Ａ６）的磁性纳米颗粒捕获溶液中的蓖麻毒素，再加入偶联有抗蓖麻毒素单克隆抗体（７Ｇ７）的胶体金纳米颗粒，利用胶体金催化硝酸银和对苯二酚的氧化还原反应，使银颗粒沉积在胶体金表面。将磁性纳米颗粒－抗原－胶体金－银颗粒复合物转移到组合微叉指电极上，烘干，测定该复合物引起电极间电容值的变化。通过更换探针分子，这种新方法可以广泛的用于各种毒素或病毒的检测。与传统双抗夹心ＥＬＩＳＡ比较，这种基于两种纳米颗粒建立的电容检测系统具有灵敏度高，检测速度快等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测蓖麻毒素的新方法，具体的说，本专利技术建立了一 种基于磁性纳米颗粒和胶体金纳米颗粒的电容检测系统，用于蓖麻毒素的 检测。通过更换抗体分子，这种新的检测方法可以应用于多种毒素或病毒 的检测。
技术介绍
蓖麻毒素(Ricin)是蓖麻籽中含有的一种植物糖蛋白，分子量60-65 kDa。毒素粉末无色无味，干燥品在室温下稳定，升温也不分解，甚至干 热到IO(TC时对毒性影响也很小，随水分含量的增高稳定性下降，水中煮 沸可使其失活。蓖麻毒素由A和B两条多肽链组成，两链间由一个二硫 键连接。毒素B链上含有两个半乳糖，可和细胞表面的含半乳糖结合位点 结合，通过内陷作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素属于蛋白合成 抑制剂或核糖体失活剂。蓖麻毒素以其极强的毒性和致死率而受到各国的普遍重视。在1997 年生效的《禁止化学武器公约》中，已将蓖麻毒素列入公约的一级控制清 单。美国反恐专家组18位专家曾联合发布白皮书，认为蓖麻毒素最有可 能成为未来战争或恐怖主义者首先使用的生化武器。根据这部白皮书， 2001年美国反恐规划把蓖麻毒素列入最可能使用的毒剂之一。目前检测蓖 麻毒素的研究已经成为全世界防御未来生物战争或恐怖主义的重要策略。 因此，建立毒素检测系统，加强检测蓖麻毒素的技术储备不仅是十分必要 的，而且是迫切需要的。电容传感器是建立在平板电容模型基础上的一种传感技术，通过测量 电容的变化来反映系统的一些特性。平板电容器的电容值可以由下是计算4c = A:——其中s是极板间介质的介电常数，s = ￡。& 是空气的介电常数，^是电介质的介电常数S是两极板的正对面积^是两极板的距离A是常系数由公式可以看出，电容值与介电常数极板正对面积S和极板间距d有关，当这三个参数中的任意一个改变时电容都会随之发生改变。因此根据改变电容器的参数不同，电容传感器可以分为三类可变间距式、可变面积式和可变电介质式，根据不同的物理量测量需要可以选择不同的传感器类型。例如可变间距式多用于测量位移、加速度等；可变面积式用来测量角度变化；可变电介质式测量多用于测量液位、物质种类等等。
技术实现思路
在本专利技术中使用了抗蓖麻毒素的单克隆抗体7G7、 8C2和6A6。分别分泌单克隆抗体7G7、 8C2和6A6的杂交瘤细胞7G7、 8C2和6A6商购自北京盛源枫科技发展有限公司。杂交瘤细胞的制备过程如下(参见Kohler和Milstein, A^we 256:495,1975; Yeh et al, Prac. A^/.1979; Yeh et al., / Cacer，1982):以天然纯化经甲醛灭活的蓖麻毒素全毒素作为免疫原对BALB/C小鼠进行免疫接种，每次皮下注射20吗蛋白海只鼠，每两星期一次，共三次。取脾细胞之前加强免疫一次，皮下注射20pg蛋白每只鼠。加强免疫之后三天，取脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和SP2/0-Ag14鼠骨髓瘤细胞进行融合，并用HAT选择性培养基(含次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymiclin)的培养基)对杂交瘤进行筛选，获得杂交瘤细胞。用ELISA的方法筛选与天然蓖麻毒素有强结合能力的抗体，获得三株抗体，分别命名为7G7、 8C2和6A6，同时获得分泌这些抗体的杂交瘤细胞，依次是7G7、 8C2禾Q6A6。本专利技术人鉴定了这三株抗体均属IgGl亚型。ELISA证实了这些抗体和蓖麻毒素的特异性结合。利用免疫印迹(Western blotting)的方法，证实6A6识别蓖麻毒素的 A链，7G7和8C2识别蓖麻毒素的B链。本专利技术同时利用识别A链的抗体，如6A6;和识别B链的抗体，如 7G7，开发了一套夹心ELISA的方法，用于检测蓖麻毒素。利用6A6和7G7两株抗体，建立了一种基于两种纳米颗粒的电容检 测系统，该系统利用偶联有抗蓖麻毒素单克隆抗体(6A6)的磁性纳米颗 粒捕获溶液中的蓖麻毒素，再加入偶联有抗蓖麻毒素单克隆抗体(7G7) 的胶体金纳米颗粒，利用胶体金催化硝酸银和对苯二酚的氧化还原反应， 使银颗粒沉积在胶体金表面。将磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物 转移到组合微叉指电极上，烘干，测定该复合物引起电极间电容值的变化。本专利技术是通过改变电极间的电介质来实现对蓖麻毒素检测的。当溶液 中存在蓖麻毒素时，会形成磁性纳米颗粒-蓖麻毒素-胶体金-银颗粒复合 物。由于银颗粒具有良好的导电性，介电常数远大于空气，因而当极板间 有银颗粒存在时，会引起电容值的显著增加。在本专利技术的一个实施方案中，所述的磁性纳米颗粒为二氧化硅包埋式 四氧化三铁磁性纳米颗粒，直径为1 pm。在本专利技术的另一个实施方案中，所述的偶联磁性纳米颗粒的单克隆抗 体为6A6。在本专利技术的另一个实施方案中，所述的胶体金纳米颗粒直径为10nm。 在本专利技术的另一个实施方案中，所述的偶联胶体金颗粒的单克隆抗体 为7G7。在本专利技术的另一个实施方案中，所述的组合微叉指电极是利用电子线 路加工工艺加工而成，电极厚度是0.1jam。基底是环氧树脂材料，厚度为 1.48 mm。在本专利技术的另一个实施方案中，所述的组合微叉指电极，其特征在于其中相邻叉指间距为100 pm，指宽度为0.3 mm，交叉部分的长度为4 mm。 在本专利技术的另一个实施方案中，通过更换抗体分子，所述方法可用于 多种毒素或病毒的检测。更具体地，本专利技术涉及以下各项1. 一种利用磁性纳米材料和胶体金纳米材料检测蓖麻毒素的夹心 ELISA方法，包括将偶联有一种抗蓖麻毒素单克隆抗体的磁性纳米颗粒与待测样品混合，以捕获蓖麻毒素；加入偶联有另一种抗蓖麻毒素单克隆抗体的胶体金纳米颗粒； 加入硝酸银和对苯二酚反应，形成磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物；将上述磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物转移到包括电极的电 容检测系统中，检测电极间电容值的改变。2. 根据以上1的方法，其中所述磁性纳米颗粒为二氧化硅包埋式四氧 化三铁磁性纳米颗粒，该材料是以四氧化三铁磁性纳米颗粒为核，外面包 覆了一层二氧化硅材料制得。3. 根据以上1的方法，其中所述胶体金纳米颗粒为氯金酸-柠檬酸钠 法合成的金纳米颗粒。4. 根据以上1或2的方法，其中所述磁性纳米颗粒偶联的单克隆抗体 为6A6。5. 根据以上1或3的方法，其中所述胶体金纳米颗粒偶联的单克隆抗 体为7G7。6. 根据以上l的方法，其中所述电极是组合微叉指电极，该电极是由 传统的平板电极并列叠加而成。7. 根据以上l的方法，该方法是在溶液中进行的，优选所述磁性纳米 颗粒偶联的单克隆抗体和所述胶体金纳米颗粒偶联的单克隆抗体是相同 或不同亚型的IgG，识别蓖麻毒素的相同链或不同链，更优选为鼠源单克 隆抗体。8. —种利用磁性纳米颗粒和胶体金纳米颗粒检测样品中抗原的夹心 ELISA方法，包括将偶联有一种针对所述抗原的单克隆抗体的磁性纳米颗粒与待测样品 混合，以捕获蓖麻毒素；加入偶联有另一种针对所述抗原的单克隆抗体的胶体金纳米颗粒；加入硝酸银和对苯二酚反应，形成磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物；将上述磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物转移到包括电极的电容检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用磁性纳米材料和胶体金纳米材料检测蓖麻毒素的双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法，包括：　　　　将偶联有一种抗蓖麻毒素单克隆抗体的磁性纳米颗粒与待测样品混合，以捕获蓖麻毒素；　　　　加入偶联有另一种抗蓖麻毒素单克隆抗体的胶体金纳米颗粒；　　　　加入硝酸银和对苯二酚反应，形成磁性纳米颗粒－抗原－胶体金－银颗粒复合物；　　　　将上述磁性纳米颗粒－抗原－胶体金－银颗粒复合物转移到包括电极的电容检测系统中，检测电极间电容值的改变。

【技术特征摘要】
1.一种利用磁性纳米材料和胶体金纳米材料检测蓖麻毒素的双抗夹心ELISA方法，包括将偶联有一种抗蓖麻毒素单克隆抗体的磁性纳米颗粒与待测样品混合，以捕获蓖麻毒素；加入偶联有另一种抗蓖麻毒素单克隆抗体的胶体金纳米颗粒；加入硝酸银和对苯二酚反应，形成磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物；将上述磁性纳米颗粒-抗原-胶体金-银颗粒复合物转移到包括电极的电容检测系统中，检测电极间电容值的改变。2. 根据权利要求1的方法，其中所述磁性纳米颗粒为二氧化硅包埋式 四氧化三铁磁性纳米颗粒。3. 根据权利要求1的方法，其中所述胶体金纳米颗粒为氯金酸-柠檬 酸钠法合成的金纳米颗粒。4. 根据权利要求1或2的方法，其中所述磁性纳米颗粒偶联的单克隆 抗体为6A6。5. 根据权利要求1或3的方法，其中所述胶体金纳米颗粒偶联的单克 隆抗体为7G7。6. 根据权利要求1的方法，其中所述电极是组合微叉指电极。7. 根据权利要求l的方法，该方法是在溶液中进行的，优选所述磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎锡蕴，庄洁，冯静，杨东玲，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]