【技术实现步骤摘要】
本申请属于高通量测序，具体涉及一种滚环扩增的方法以及dna纳米球的制备方法。
技术介绍
1、滚环扩增（rca）是一种在二代测序及原位测序等领域常见的文库扩增方法。通过环状dna为起始模板，在具有链置换功能的聚合酶的作用下，在等温环境中进行扩增。其产物是一根线性的，多个与环状dna序列反向互补的序列的连续。其产物的形态可以通过环状dna上的固定序列进行一定程度的调控。相对pcr而言，滚环扩增的扩增倍数较少，但是不需要频繁的变温，同时可以避免pcr带来的错误累积。因此在特定情况下，比pcr更有优势。
2、滚环扩增相对于其他扩增而言，最重要的是环状dna的制作。这一步骤极为繁琐。以常规pcr产生的双链dna为例，首先需要对其单链化，即选择一条链进行消化，同时对剩余单链的5’端要进行磷酸化。在获得单链状态，5’磷酸化后的dna单链模板后，要通过能与该dna单链首尾同时杂交的成环引物，将dna单链模板的3’端引导至5’端，且处于3’端碱基3’羟基与5’端碱基的5’磷酸基团处于相邻位置。之后在dna连接酶的作用下，将dna单链模板的3’端与5’端相连，形成一个完整的环。之后要对产物进行纯化和消化，去除未成环的产物，仅保留环状dna。这一系列步骤通常需要人工操作，即使使用专业的试剂盒，也很难实现自动化。这一点在华大基因早期的基因测序仪产品中表现的尤为明显。在其测序的准备中，将打断或者pcr后的文库进行环化的步骤流程长，效率低，起始文库投入量大。在之后的发展中，包括华大基因在内的一些公司推出了一步法构建dna纳米球的产品或专利，整合
3、现有公开的各种一步法方案，也实际需要多个操作步骤，并且借助pcr热循环仪才能完成dna纳米球的制作。如以目前公开的一步法构建dna纳米球的试剂盒举例来说：
4、用户首先要稀释双链文库并与试剂mix1混合，然后使用pcr热循环仪将混合液升温至变性，再降温至复性，之后加入试剂mix2，设置某一温度进行一段时间的反应，之后加入终止剂，终止反应。其主要弊端如下：
5、1. 多个试剂加入步骤需要反复开关pcr热循环仪及样品容器，极易引来外源性污染。
6、2. 这些步骤需要多个不同的精确控制的温度，使得pcr热循环仪成为必需品，抬高了使用门槛。
7、3. 同时为了精确控温，pcr热循环仪对反应容器容量也有限制，大多为200μl。这使得制作大量dna纳米球时，需要在多个pcr管中进行。同时在后续加入试剂时，也需要分别向各个pcr管中加入，这样极易导致各pcr中产物不一致的结果。
8、4. 由于需要多次升降温精确控制在多个温度点，以及需要向多个pcr管多次加入试剂，实际的dna纳米球制作时间远远大于pcr热循环仪上设置的孵育时间。
9、在成熟的商品化的一步法试剂中，也有类似的情况，如mgi dnbseq-e25rs 高通量测序试剂套装。它们大致的技术原理与流程设置如图1-图2所示。
技术实现思路
1、基于此，本申请一实施方式有必要提供一种滚环扩增的方法，该方法能够用于制备dna纳米球。
2、技术方案包括如下：
3、滚环扩增的方法，所述方法在恒温条件下进行的，包括如下步骤：
4、将双链dna与变性剂混合后进行变性，制备变性体系，其中所述双链dna中至少一条链的5’端被磷酸化；
5、所述dna双链变性后，在所述变性体系中同时引入包括成环片段、连接酶和聚合酶的试剂，制备反应体系；在所述反应体系中，变性后的单链dna两端与所述成环片段同时进行配对，所述连接酶使所述单链dna两端连接，形成单链dna环，所述聚合酶以所述成环片段为引物、以所述单链dna环为模板进行滚环扩增。
6、在其中一个实施例中，引入的包括所述成环片段、所述连接酶和所述聚合酶的试剂总体积是所述变性体系体积的1-1000倍。
7、可选地，引入的包括所述成环片段、所述连接酶和所述聚合酶的试剂总体积是所述变性体系体积的1-500倍；可选地，引入的包括所述成环片段、所述连接酶和所述聚合酶的试剂总体积是所述变性体系体积的80-150倍。
8、可选地，引入的包括所述成环片段、所述连接酶和所述聚合酶的试剂总体积是所述变性体系体积的15-20倍。
9、在其中一个实施例中，所述变性剂包括强碱和甲酰胺中的一种或多种；可选地，所述变性剂为强碱；进一步可选地，所述强碱包括naoh和koh；可选地，所述强碱在所述变性体系中的浓度在mol/l水平。
10、在其中一个实施例中，所述恒温条件为40℃-80℃。
11、在其中一个实施例中，所述连接酶是耐热型的连接酶，所述聚合酶是耐热型的聚合酶，所述连接酶和所述聚合酶适合的反应温度在20℃-100℃范围内。
12、在其中一个实施例中，所述连接酶和所述聚合酶的作用反应时间为10min-100min；可选地，所述连接酶和所述聚合酶的作用反应时间为10min-15min。
13、在其中一个实施例中，所述反应体系中还引入atp、盐和中和剂中的一种或多种；
14、在其中一个实施例中，所述盐包括tris-hcl、四甲基氯化铵（etramethylammoniumchloride）和mg(ch3coo)2中的一种或多种；
15、在其中一个实施例中，所述中和剂包括酸。
16、在其中一个实施例中，所述反应体系的体积为1μl-100ml；可选地，所述反应体系的体积为80μl-10ml。
17、一种dna纳米球的制备方法，包括所述的方法制备dna纳米球；可选地，制备方法还包括用终止剂终止扩增反应，得到dna纳米球。
18、一种测序方法，包括如下步骤：
19、根据所述的滚环扩增的方法制备dna纳米球；以及，
20、对所述dna纳米球进行测序，以便获得测序结果。
21、相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
22、本申请提供了一种温和恒温下快速进行滚环扩增的方法，dna纳米球在该方法中反应的起始物是至少一个5’端被磷酸化的dna双链，不再是dna单链环，省去了dna纳米球制作过程中繁琐环化和纯化过程；同时该方法实在接近室温的条件下恒温进行的，仅需简单的恒温设备，无需昂贵的控温设备参与温度的升降；同时该方法的试剂加入方式进行了简化，不需要额外的复性剂，反应中向体系内加入试剂的次数得以减少；同时该方法避免了pcr管的限制，可以在单一反应容器内，进行大体积的dna纳米球的制作，避免了大批量dnb制作中产生的批间差异。综上本方法简化了实验步骤，降低了实验设备的要求，增大了最大反应规模的限制，提高了反应效率，降低了反应中操作的干扰。
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1.滚环扩增的方法，其特征在于，所述方法在恒温条件下进行的，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，引入的包括所述成环片段、所述连接酶和所述聚合酶的试剂总体积是所述变性体系体积的1-1000倍；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述变性剂包括强碱和甲酰胺中的一种或多种；
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，变性的时间不超过5min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述恒温条件为40℃-80℃；
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述连接酶是耐热型的连接酶，所述聚合酶是耐热型的聚合酶，所述连接酶和所述聚合酶适合的反应温度在20℃-100℃范围内。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述连接酶和所述聚合酶的作用反应时间为10min-100min；
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述成环片段仅与DNA双链中的一条链的两端同时配对，且配对的一条链的5’端是磷酸化的。
9.根据权利要求1或2所述的方
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反应体系的体积为1μL-100mL；
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用恒温加热器或PCR热循环仪保持恒温条件。
12.一种DNA纳米球的制备方法，其特征在于，包括采用权利要求1-11任一项所述的方法制备DNA纳米球；
13.一种测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.滚环扩增的方法，其特征在于，所述方法在恒温条件下进行的，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，引入的包括所述成环片段、所述连接酶和所述聚合酶的试剂总体积是所述变性体系体积的1-1000倍；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述变性剂包括强碱和甲酰胺中的一种或多种；
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，变性的时间不超过5min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述恒温条件为40℃-80℃；
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述连接酶是耐热型的连接酶，所述聚合酶是耐热型的聚合酶，所述连接酶和所述聚合酶适合的反应温度在20℃-100℃范围内。
7.根据权利要求1或2所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，谢槟，陈星羽，肖育劲，
申请(专利权)人：深圳市大道测序生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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