【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医生物，尤其涉及一株特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3、单链抗体及制备方法。
技术介绍
1、布鲁菌病，简称布病，是一种重要的人畜共患细菌性传染病。犬种布鲁菌是引起犬布病的主要病原菌之一，也是导致犬不孕不育的原因之一。患病犬进入犬舍后，可通过消化道、呼吸道、皮肤和黏膜接触传播，速度较快，并且大多数公犬呈隐性感染，感染后不表现临床症状，而感染后母犬妊娠期会发生流产，极少数免疫力较低的公犬会表现出睾丸炎、附睾炎、心内膜炎、葡萄膜炎和椎间盘脊柱炎等临床症状。犬种布鲁菌感染后不易发现，且临床血清的特异性抗体会随着时间推移而逐渐降低至无法检出，给临床筛查和治疗带来较大难度。
2、犬布病的防控主要通过检疫和扑杀，犬种布鲁菌相较于其他种属布鲁菌，如牛种和羊种布鲁菌，其表面脂多糖缺失o-抗原结构，表现为粗糙表型。o-抗原是布鲁菌诱导宿主产生检测抗体的主要成份，该组份的缺失导致常规血清学检测方法难以适用于犬种布鲁菌感染的检测。因此，基于免疫原性蛋白的检测方法在犬布病的检测方法的开发中具有重要意义。
3、bp26蛋白为布鲁菌一种主要的免疫原性蛋白，由于bp26在布鲁菌属中高度特异，且其他细菌属中没有，因此，bp26认定为布鲁菌病的特异性诊断标记物。并且，有研究表明bp26与脂多糖均具备较强的反应性，故bp26替代脂多糖开发布鲁菌病诊断试剂具有较好的应用前景。然而，根据文献报道，使用bp26蛋白作为诊断抗原存在明显的非特异性反应。因此，针对bp26蛋白，制备单克隆抗体或单链抗体，再通过该特异性抗体开发竞争
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一株特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3、单链抗体及制备方法，根据该特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3制备的单链抗体可与bp26蛋白结合，与bp26蛋白具有较好的反应原性。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一株特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2024年7月4日，保藏编号为：cgmcc no.46015。
4、优选的，所述特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株的构建方法为：
5、将犬种布鲁菌bp26蛋白免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与sp2/0细胞按10:1的比例混合进行细胞融合，筛选得到特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3。
6、本专利技术还提供了一种针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体，所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体是基于上述特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3制备的。
7、优选的，所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体的基因序列如seq id no.9所示。
8、优选的，所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体的氨基酸序列如seq id no.10所示。
9、本专利技术还提供了一种针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
10、(1)提取单克隆细胞株2d3的rna，并反转录为cdna，使用简并引物通过pcr扩增获得表达单克隆抗体的轻链可变区基因vl和重链可变区基因vh；通过重叠pcr将vl和vh基因经柔性肽链进行连接，获得完整的单链抗体基因；
11、(2)将步骤(1)获得的单链抗体基因与pcold-tf载体进行连接，转化至bl21感受态细胞中进行诱导表达，得到针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体。
12、优选的，步骤(1)中扩增所述vl的简并引物序列为seq id no.1所示的vlf和seq idno.2所示的vlr；扩增所述vh的简并引物序列为seq id no.3所示的vhf和seq id no.4所示的vhr。
13、优选的，步骤(1)中所述轻链可变区基因vl的基因序列如seq id no.5所示，所述重链可变区基因vh的基因序列如seq id no.6所示。
14、优选的，所述轻链可变区基因vl的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述重链可变区基因vh的氨基酸序列如seq id no.8所示。
15、本专利技术还提供了一种针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体在制备犬种布鲁菌检测试剂盒上的应用。
16、本专利技术所述的针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体与现有技术相比的有益效果为：
17、(1)本专利技术通过原核表达系统表达和纯化了犬种布鲁菌bp26蛋白。随后，通过该蛋白免疫小鼠，取脾细胞与sp2/0细胞体外融合，elisa筛选获得一株能特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3。将单克隆细胞株2d3注射至小鼠后，小鼠腹水制备的单克隆抗体的elisa效价为1:12800，并且单克隆细胞株2d3分泌的单克隆抗体与bp26蛋白具有较好的反应原性。
18、(2)本专利技术通过提取特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3的rna，并反转录为cdna，使用简并引物通过pcr扩增获得表达单克隆抗体的轻链可变区基因vl和重链可变区基因vh，进而通过重叠pcr将vl和vh基因经柔性肽链进行连接，获得完整的单链抗体基因。将该基因与pcold-tf载体进行连接，转化至bl21(de3)感受态细胞中进行诱导表达，得到针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体。该针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体可与bp26蛋白结合，与bp26蛋白具有较好的反应原性，还能抑制单克隆抗体与bp26蛋白结合，对于开发新型的布病检测试剂具有重要意义。
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1.一株特异性分泌BP26抗体的单克隆细胞株2D3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2024年7月4日，保藏编号为：CGMCCNO.46015。
2.根据权利要求1所述特异性分泌BP26抗体的单克隆细胞株2D3，其特征在于，所述特异性分泌BP26抗体的单克隆细胞株的构建方法为：
3.一种针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体，其特征在于，所述针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体是基于权利要求1所述特异性分泌BP26抗体的单克隆细胞株2D3制备的。
4.根据权利要求3所述针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体，其特征在于，所述针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求4所述对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.一种权利要求3～5任一项所述针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于
7.根据权利要求6所述对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中扩增所述VL的简并引物序列为SEQ ID NO.1所示的VLF和SEQ ID NO.2所示的VLR；扩增所述VH的简并引物序列为SEQ ID NO.3所示的VHF和SEQ ID NO.4所示的VHR。
8.根据权利要求6所述对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述轻链可变区基因VL的基因序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区基因VH的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
9.根据权利要求8所述对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述轻链可变区基因VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链可变区基因VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
10.一种权利要求3～5任一项所述针对犬种布鲁菌BP26蛋白的单链抗体在制备犬种布鲁菌检测试剂盒上的应用。
...【技术特征摘要】
1.一株特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2024年7月4日，保藏编号为：cgmccno.46015。
2.根据权利要求1所述特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3，其特征在于，所述特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株的构建方法为：
3.一种针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体，其特征在于，所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体是基于权利要求1所述特异性分泌bp26抗体的单克隆细胞株2d3制备的。
4.根据权利要求3所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体，其特征在于，所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体的基因序列如seq id no.9所示。
5.根据权利要求4所述对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述针对犬种布鲁菌bp26蛋白的单链抗体的氨基酸序列如seq id no.10所示。
6.一种权利要求3～5任一项所述针对犬种...
【专利技术属性】
技术研发人员：田明星，王少辉，孙鹏翔，祁晶晶，鲍衍清，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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