【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器，具体涉及一种检测egfr基因突变的电化学传感器及其制备方法。
技术介绍
1、egfr属于受体酪氨酸激酶家族，与细胞信号通路的激活密切相关，包括细胞增殖和凋亡保护。相关研究表明，egfr在多种肿瘤中均有过度表达，尤其是非小细胞肺癌(nsclc)。通过egfr而设计的酪氨酸激酶抑制剂可显著改善nsclc的临床病程，但仅对携带egfr基因激活突变的肿瘤有效，这种突变主要存在于酪氨酸激酶区域18-21外显子，其中egfr 19缺失(del e746-a750)和egfrl858r点突变占90％。egfr 19缺失发生最频繁，约占48％。
2、目前，用于egfr突变基因检测的首选方案仍然是基因测序法，包括sanger测序、高通量测序(next generation sequencing,ngs)、单分子测序等。其作为基因检测的金标准，不但能检测突变存在的情况，还能确定突变的位置，且能同时检测多位点突变。但是该检测方法存在以下缺陷：
3、1、数据处理复杂：由于基因测序产生的数据量巨大，数据处理和分析需要复杂的算法和计算资源，因此需要专业的技术和设备支持。
4、2、费用昂贵：尽管随着技术的进步，测序成本已经大幅降低，但仍然是一项昂贵的技术，尤其是在大规模测序或个体化医疗方面。
5、3、检测周期长：基因测序的检测周期最短可在数天完成检测，最长可到数周，具体取决于实验室的实验流程、设备性能、数据处理和分析的复杂程度以及实验室的工作负荷等因素。
6、4、侵入性大：
技术实现思路
1、针对现有技术中egfr突变基因的检测方法存在的数据处理复杂、费用昂贵、检测周期长以及侵入性大等问题，本专利技术提供了一种检测egfr基因突变的电化学传感器及其制备方法。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种检测egfr基因突变的电化学传感器，包括传感器平台、连接启动的lamp靶标核酸扩增体系以及cas12a-crrna双链体；
4、所述传感器平台包括工作电极和修饰在工作电极表面上的具有导电性能的复合纳米层，所述复合纳米层上设置有由报告基因组成的dna单层，所述报告基因为亚甲基蓝-单链dna(mb-ssdna)；
5、所述连接启动的lamp靶标核酸扩增体系包括：茎环lamp探针lp、茎环lamp探针lp-pam、前内引物fip、后内引物bip，所述连接启动的lamp靶标核酸扩增体系用于通过连接启动的lamp扩增靶标核酸，并得到dna结构混合物；
6、所述cas12a-crrna双链体用于特异性识别dna结构混合物中的egfr基因的e746-a750缺失突变基因mut dna，并在识别后激活cas12a的反式切割活性，将报告基因从工作电极上非特异性切割脱落。
7、进一步地，所述复合纳米层(gdy-autnps)为经聚赖氨酸改性的片层石墨炔(gdy)-形貌为三角纳米片状的金纳米粒子复合纳米层(gdy-autnps)。
8、进一步地，茎环lamp探针lp的基因序列为：
9、p/ttgatagcgatttatcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgat；
10、茎环lamp探针lp-pam的基因序列为：
11、cgacagcagaggatttgttgtgtggaagtgtgagcggattttcctctgctgtcgtttgcggagatgtt。
12、进一步地，扩增前内引物fip的基因序列为：
13、atcgtcgtgactgaaagtgcggggctctgtcctattac；
14、扩增后内引物bip的基因序列为：
15、cgacagcagaggatttgttgtgtggaagtgtgagcgga。
16、进一步地，cas12a-crrna双链体中的crrna的基因序列为：
17、uaauuucuacuaaguguagaucggagauguuuugauagcga。
18、作为优选，所述工作电极为玻碳电极。
19、一种检测egfr基因突变的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
20、步骤a：制备复合纳米材料；
21、步骤b：利用步骤a制备复合纳米材料对工作电极进行修饰，并将亚甲基蓝-单链dna连接到复合纳米层上得到传感器平台；
22、步骤c：构建连接启动的lamp靶标核酸扩增体系；
23、步骤d：构建cas12a-crrna双链体。
24、进一步地，所述复合纳米材料为经聚赖氨酸改性的片层石墨炔-形貌为三角纳米片状的金纳米粒子复合纳米材料，步骤a中制备复合纳米材料的详细步骤包括：
25、步骤a1：使用聚赖氨酸对片层石墨炔进行改性；
26、步骤a2：采用种子生长法制备形貌为三角纳米片状的金纳米粒子；
27、步骤a3：通过静电吸附将形貌为三角纳米片状的金纳米粒子修饰在经聚赖氨酸改性的片层石墨炔表面获得复合纳米材料。
28、进一步地，步骤b得到传感器平台的具体步骤如下：
29、步骤b1：对工作电极上添加复合纳米材料，得到经复合纳米材料修饰的工作电极；
30、步骤b2：通过还原巯基将报告基因连接固定在经复合纳米材料修饰的工作电极上，得到传感器平台。
31、综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
32、1.本专利技术能快速检测待测样本的egfr基因突变，根据定量结果并结合临床症状可以缩减诊疗时间。从开始检测到诊治出结果，只需取样、处理、上样、显示结果、结果扫描判读及咨询，其中所耗时间仅需要5-10分钟。传统检查模式就诊：往返医院、排队挂号缴费、取样、检测、医生诊治，其耗时至少6小时。
33、2.本专利技术中通过lamp引物启动的特异性扩增和crispr/cas12a系统的靶标识别和激活切割能力双重保证了传感检测的特异性。根据目标突变dna设计的lamp连接启动引物，可特异性识别目标dna，crispr/cas12a系统通过crrna对lamp产物进一步特异性识别并激活cas12a的核酸切割酶活性，达到对目的突变dna双重特异性识别的效果。
34、3.本专利技术中使用性能优异的复合纳米材料gdy-au tnps整体上提高传感策略灵敏度。au tnps独特的大晶体表面可以紧密地粘附在gdy的表面，使gdy-au tnps成为一种利用硫醇基团吸附固定核酸的高载流子迁移率的纳米材料，并为单链报告基因提供强活性、大面积的结合微环境，从而进一步提升了设计的传感技术的灵敏度。
35、4.本专利技术一方面采用连接启动的lamp来扩增序列特异性的核酸靶点，设计一对茎环序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测EGFR基因突变的电化学传感器，其特征在于：包括传感器平台、连接启动的LAMP靶标核酸扩增体系以及Cas12a-crRNA双链体；
2.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器，其特征在于：所述复合纳米层为经聚赖氨酸改性的片层石墨炔-形貌为三角纳米片状的金纳米粒子复合纳米层。
3.根据权利要求1或2所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器，其特征在于：
4.根据权利要求1或2所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器，其特征在于：扩增前内引物FIP的基因序列为：
5.根据权利要求1或2所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器，其特征在于：Cas12a-crRNA双链体中的crRNA的基因序列为：
6.根据权利要求1或2所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器，其特征在于：所述工作电极为玻碳电极。
7.一种权利要求1-6任一项所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器的制备方法，其
9.根据权利要求7所述的检测EGFR基因突变的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤B得到传感器平台的具体步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种检测egfr基因突变的电化学传感器，其特征在于：包括传感器平台、连接启动的lamp靶标核酸扩增体系以及cas12a-crrna双链体；
2.根据权利要求1所述的检测egfr基因突变的电化学传感器，其特征在于：所述复合纳米层为经聚赖氨酸改性的片层石墨炔-形貌为三角纳米片状的金纳米粒子复合纳米层。
3.根据权利要求1或2所述的检测egfr基因突变的电化学传感器，其特征在于：
4.根据权利要求1或2所述的检测egfr基因突变的电化学传感器，其特征在于：扩增前内引物fip的基因序列为：
5.根据权利要求1或2所述的检测egfr基因突变的电化学传感器，其特征在于：cas12a-cr...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈梅，陈祠志，付杨，魏雨忻，何林欣，谢林芝，
申请(专利权)人：成都医学院，
类型：发明
国别省市：
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