【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，尤其涉及ascandinines类吲哚二萜化合物、生物合成基因簇、合成方法及应用。
技术介绍
1、吲哚二萜是一类主要来源于青霉属、曲霉属、麦角属真菌的杂萜生物碱。其核心结构由一个来源于色氨酸的吲哚部分和一个由四个异戊二烯单元组成的二萜骨架组成。核心骨架上经过各种结构修饰生成系列结构复杂的衍生物，如氧化、环化、卤化、以及添加额外的异戊二烯单元等。这些化合物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗虫和离子通道抑制等活性，在农业和医药领域具有可观的应用前景。研究表明，部分吲哚二萜已被应用于药物研发。例如，作为bk通道阻滞剂，吲哚二萜已被证明可以降低眼压并用于治疗青光眼。h1n1病毒是一种可导致人类死亡的侵袭性流感病毒株，许多吲哚二萜对其具有显著抑制活性。
2、真菌aspergillus candidus hdn15-152中产生一类罕见的具有6/5/5/6/6/6稠合环系的吲哚二萜ascandinines，其具有良好的生物活性，如抗菌、抗感染、抗结核、抗甲型h1n1流感病毒以及抗肿瘤活性等。据报道，通过异源表达等方法，多种真菌来源吲哚二萜的生物合成已被深入研究，但尚未由6/5/5/6/6/6/6稠合环系吲哚二萜生物合成的报道。因此，利用异源表达解析此类化合物的生物合成并得到此类结构新颖的化合物为抗菌、抗病毒和抗肿瘤研究提供先导化合物实体具有重要的研究意义及良好的应用前景。
技术实现思路
1、为克服相关技术中存在的问题，本专利技术公开实施例提供了一种类吲哚二萜化合物
2、所述技术方案如下：一种ascandinines类吲哚二萜化合物的生物合成基因簇，该生物合成基因簇为ascandinines类吲哚二萜生物合成基因簇asc，所述生物合成基因簇来源于真菌aspergillus candidus hdn15-152，并含有吲哚二萜生物合成的核心骨架基因ascgcmb，1个簇特异性的转录调控基因ascd，1个萜环化酶基因asca，1个乙酰辅酶a合成酶基因asce，2个乙酰转移酶基因asctv和5个氧化还原酶的基因ascpqwjn；
3、核心骨架基因ascgcmb的基因序列为seq id no：1，1个萜环化酶基因asca的基因序列为seq id no：2，1个乙酰辅酶a合成酶基因asce的基因序列为seq id no：3，2个乙酰转移酶基因asctv的基因序列为seq id no：4，5个氧化还原酶的基因ascpqwjn的基因序列为seq id no：5；1个簇特异性的转录调控基因ascd的基因序列为seq id no：20；在5个氧化还原酶的基因ascpqwjn中，还包括：4个细胞色素p450单加氧酶和1个黄素依赖的单加氧酶。
4、本专利技术的另一目的在于提供一种ascandinines类吲哚二萜化合物，该ascandinines类吲哚二萜化合物为一类含有6/5/5/6/6/6/6稠合环系的吲哚二萜，利用所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的生物合成基因簇合成，该ascandinines类吲哚二萜化合物的核心化合物为含有6/5/5/6/6/6/6稠合环系的吲哚二萜ascandinine g，化学结构如下：
5、
6、本专利技术的另一目的在于提供一种一种ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，该方法对所述的ascandinines类吲哚二萜化合物进行合成，包括以下步骤：
7、s1，基因异源表达载体的构建；s2，构巢曲霉异源表达菌株的构建；s3，构巢曲霉异源表达菌株培养与发酵；s4，发酵培养5天后，发酵产物用适量乙酸乙酯浸没过夜，超声，减压浓缩得到浸膏提取物，获得的浸膏提取物经ods硅胶柱层析分离富集目标组分；通过半制备柱纯化，获得单体化合物，即类吲哚二萜化合物。
8、在步骤s1中，基因异源表达载体的构建包括：首先，利用pcr技术，以aspergilluscandidus hdn15-152基因组dna为模板扩增出目的基因ascgcmbpqw；然后，将目的基因分别连接到构巢曲霉表达质粒pytu、pytr和pytp质粒中，构建重组表达质粒pytu-asccbm、pytr-ascgpw和pytp-ascq；
9、扩增出目的基因ascgcmbpqw中应用的引物包括：
10、pytu-ascc-f、pytu-ascc-r，基因序列分别为seq id no：6、seq id no：7；
11、pytu-ascb-f、pytu-ascb-r，基因序列分别为seq id no：8、seq id no：9；
12、pytu-ascm-f、pytu-ascm-r，基因序列分别为seq id no：10、seq id no：11；
13、pytr-ascg-f、pytr-ascg-r，基因序列分别为seq id no：12、seq id no：13；
14、pytr-ascp-f、pytr-ascp-r，基因序列分别为seq id no：14、seq id no：15；
15、pytr-ascw-f、pytr-ascw-r，基因序列分别为seq id no：16、seq id no：17；
16、pytp-ascq-f、pytp-ascq-r，基因序列分别为seq id no：19、seq id no：19。
17、在步骤s2中，构巢曲霉异源表达菌株的构建，包括：通过peg转化的方法，将表达载体pytu-asccbm、pytr-ascgpw和pytp-ascq转化至构巢曲霉a.nidulans a1145的原生质体中，得到转化子an-ascgcmbpqw。
18、在步骤s3中，构巢曲霉异源表达菌株培养与发酵，包括：将转化子an-ascgcmbpqw接种于筛选培养基中培养，并培养于发酵培养基中，获得代谢产物。
19、进一步，筛选培养基为cd培养基，所述cd培养基组成包括：无水葡萄糖：1g；20xnitrate salts：5ml；trace element：100μl；用无菌无酶水定容至100ml，121℃灭菌20min；使用前添加u母液1％、r母液2‰及p母液2‰；其中，u母液：称取0.056g uracil及2.442guridine，加无菌无酶水定容至10ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存；r母液：称取riboflavin 0.00125g溶于10ml无菌无酶水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存；p母液：称取pyridoxal hydrochloride 0.005g溶于10ml无菌无酶水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ascandinines类吲哚二萜化合物的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇为ascandinines类吲哚二萜生物合成基因簇asc，所述生物合成基因簇来源于真菌Aspergillus candidus HDN15-152，并含有吲哚二萜生物合成的核心骨架基因ascGCMB，1个簇特异性的转录调控基因ascD，1个萜环化酶基因ascA，1个乙酰辅酶A合成酶基因ascE，2个乙酰转移酶基因ascTV和5个氧化还原酶的基因ascPQWJN；
2.一种ascandinines类吲哚二萜化合物，其特征在于，该ascandinines类吲哚二萜化合物为一类含有6/5/5/6/6/6/6稠合环系的吲哚二萜，利用权利要求1所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的生物合成基因簇合成，该ascandinines类吲哚二萜化合物的核心化合物为含有6/5/5/6/6/6/6稠合环系的吲哚二萜ascandinine G，化学结构如下：
3.一种ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，该方法对权利要求2所述的ascandinines
4.根据权利要求3所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，在步骤S1中，基因异源表达载体的构建包括：
5.根据权利要求3所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，在步骤S2中，构巢曲霉异源表达菌株的构建，包括：
6.根据权利要求3所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，在步骤S3中，构巢曲霉异源表达菌株培养与发酵，包括：将转化子AN-ascGCMBPQW接种于筛选培养基中培养，并培养于发酵培养基中，获得代谢产物。
7.根据权利要求6所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，筛选培养基为CD培养基，所述CD培养基组成包括：无水葡萄糖：1g；20x Nitrate Salts：5mL；Trace element：100μL；用无菌无酶水定容至100mL，121℃灭菌20min；使用前添加U母液1％、R母液2‰及P母液2‰；
8.根据权利要求6所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，所述发酵培养基为CD-ST培养基，所述CD-ST培养基组成包括：可溶性淀粉：2g；
9.一种如权利要求2所述ascandinines类吲哚二萜化合物在制备抑菌药物中的应用，其特征在于，该菌包括：革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌(E.coli)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、沙门氏菌(Salminella sp.)、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)、粪肠球菌(E.faecalis)；一种真菌白色假丝酵母菌(C.albicans)，该类吲哚二萜化合物ascandinine G对S.aureus抑菌活性中，MIC为16μg/ml。
10.一种如权利要求2所述ascandinines类吲哚二萜化合物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于，该病毒包括甲型流感病毒(H1N1)。
...【技术特征摘要】
1.一种ascandinines类吲哚二萜化合物的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇为ascandinines类吲哚二萜生物合成基因簇asc，所述生物合成基因簇来源于真菌aspergillus candidus hdn15-152，并含有吲哚二萜生物合成的核心骨架基因ascgcmb，1个簇特异性的转录调控基因ascd，1个萜环化酶基因asca，1个乙酰辅酶a合成酶基因asce，2个乙酰转移酶基因asctv和5个氧化还原酶的基因ascpqwjn；
2.一种ascandinines类吲哚二萜化合物，其特征在于，该ascandinines类吲哚二萜化合物为一类含有6/5/5/6/6/6/6稠合环系的吲哚二萜，利用权利要求1所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的生物合成基因簇合成，该ascandinines类吲哚二萜化合物的核心化合物为含有6/5/5/6/6/6/6稠合环系的吲哚二萜ascandinine g，化学结构如下：
3.一种ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，该方法对权利要求2所述的ascandinines类吲哚二萜化合物进行合成，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，在步骤s1中，基因异源表达载体的构建包括：
5.根据权利要求3所述的ascandinines类吲哚二萜化合物的合成方法，其特征在于，在步骤s2中，构巢曲霉异源表达菌株的构建，包括：
6.根据权利要求3所述的ascandinines类...
【专利技术属性】
技术研发人员：张国建，汤冰颖，李德海，朱天骄，车茜，王伟，
申请(专利权)人：青岛海洋生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：
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