一种基因组连续编辑的方法技术

本发明专利技术公开了一种基因组连续编辑的方法，属于基因编辑技术领域。在第1次待插入基因片段上游连接需钠弧菌待插入位点上游1～3kbp同源臂片段，在第1次待插入基因片段下游依次连接抗性基因片段和需钠弧菌待插入位点下游1～3kbp同源臂片段，得到第1外源基因片段；依次在其余次待插入基因片段的上游连接上一次待插入基因片段下游1～3kbp同源臂片段，在其余次待插入基因片段的下游依次连接抗性基因片段和需钠弧菌待插入位点下游1～3kbp同源臂片段，得到第n外源基因片段；重复上述步骤，直至得到所有的外源基因片段；依次将获得的外源基因片段与需钠弧菌进行自然转化，实现基因组的连续编辑，解决传统基因编辑过程中长度较大的外源基因片段转化效率低的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因编辑，具体涉及一种基因组连续编辑的方法。

技术介绍

1、需钠弧菌(vibrio natriegens)是一种革兰氏染色阴性的细菌，其生长速度是已知的细菌中最快的，因其生长迅速、可用碳源广泛、蛋白表达能力强、无致病性等优点，在天然产物的生物合成、环境修复细菌的开发等方面有着广泛的应用。

2、构建具有天然产物合成、环境修复等功能的人工菌株，需要在其中外源引入相关的功能基因和基因簇，涉及基因敲除、替换、插入等编辑，需要高效率、大片段、省时省力的基因编辑方法。应用于细菌的传统基因编辑方法有基于λ-red等系统的同源重组以及crispr/cas等，但是这类方法一是需要构建并导入携带相关工具系统的辅助质粒，在需要插入较长的外源基因(或基因簇)片段时，载体质粒过大会降低转化和后续基因编辑的成功率。二是为了提高基因编辑获得阳性克隆的概率，通常需要在每次编辑的供体上添加抗生素抗性基因作为筛选标记；但抗生素及对应的抗性基因的数量均是有限的，传统的利用抗性基因进行筛选的方法不适用于在同一细菌中多次基因编辑从而插入多个基因簇的需求。

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【技术保护点】

1.一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述待插入基因片段为≤15kbp的基因簇/基因片段；若因簇/基因片段＞15kbp，按顺序将各基因片段分拆为n条长度≤15kbp的片段，作为待插入基因片段。

3.根据权利要求1所述的一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，需钠弧菌的待插入位点为chr2_179、chr2_180、chr2_182、chr2_196、chr2_297、chr2_347、chr2_457、chr2_662、chr2_761、chr2_831、chr2...

【技术特征摘要】

1.一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述待插入基因片段为≤15kbp的基因簇/基因片段；若因簇/基因片段＞15kbp，按顺序将各基因片段分拆为n条长度≤15kbp的片段，作为待插入基因片段。

3.根据权利要求1所述的一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，需钠弧菌的待插入位点为chr2_179、chr2_180、chr2_182、chr2_196、chr2_297、chr2_347、chr2_457、chr2_662、chr2_761、chr2_831、chr2_1032或chr2_1141。

4.根据权利要求1所述的一种基因组连续编辑的方法，其特征在于，所述抗性基因为氯霉素抗性基因和卡纳霉素抗性基因。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴俊彪，苏聪，黄小罗，唐鸿志，王伟伟，崔浩天，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：