【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及l-赖氨酸作为生物标志物在类风湿关节炎诊断中的应用。
技术介绍
1、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要特征的系统性自身免疫性疾病，以病变关节处有大量的炎性细胞浸润和滑膜组织过度增生为主要病理特点。ra发生常见于女性，世界范围内影响了约0.5～1％的人口。在我国，ra的发生率约为0.28％。ra病情进展迅速，病变容易导致关节功能衰退，发病1年内可能出现轻度的功能丧失，2年内往往有关节间隙变窄、骨质破坏、囊性变等临床症状发生，造成不可逆的关节骨损伤，最终导致畸形，严重影响患者的生存质量。ra发病机制复杂，目前的研究成果尚不能完全阐明其发病机制，现有的药物只能通过抑制免疫反应缓解疾病进展，无法彻底治愈ra。因此早期诊断和及时干预治疗对ra患者的预后至关重要。
2、目前ra临床诊断主要依据患者临床症状、x线表现及经典实验室指标。然而，ra在早期的临床表征较为多样，传统实验室诊断指标在临床实践中存在诸多不足，极易出现漏诊、误诊现象，从而导致患者错失最佳治疗时机。目前参与ra诊断的传统实验室指标主要为自身抗体，根据2010年美国风湿病学会/欧洲风湿病联盟(acr/eular)的分类标准，这类自身抗体主要是类风湿因子(rheumatoidfactor，rf)和抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cycliccitrullinatedpeptide antibodies，anti-ccp)。然而在实际临床应用中，rf和anti-ccp存在相当的局
3、我们前期通过非靶向代谢组学研究发现l-赖氨酸在ra患者的血清中浓度降低，具有较好的诊断ra的作用。赖氨酸为人类的必需氨基酸之一，只有l型可被生物体吸收。赖氨酸在促进人体生长发育、增强免疫力和促进脂肪氧化发挥重要作用。然而，关于l-赖氨酸在ra诊断中的作用还知之甚少。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种定量检测l-赖氨酸的高效液相色谱串联质谱方法，及其在ra诊断中的应用。本专利技术通过使用agilent 1290 infinity ii series超高效液相色谱仪和装备ajs-esi离子源的agilent 6460三重四极杆质谱仪，研发出一种定量检测l-赖氨酸的高效液相色谱串联质谱方法，且通过该方法发现，l-赖氨酸在ra患者中的浓度降低(p<0.0001)，同时受试者工作曲线分析(roc)显示，auc曲线下面积为0.93，说明l-赖氨酸在ra中具有较好的诊断价值。所以本专利技术对于ra患者的临床诊断，尤其是对血清学指标为阴性的ra患者的临床诊断，意义重大。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种l-赖氨酸的检测方法和/或检测产品在类风湿关节炎诊断产品制备中的应用。
4、进一步的，通过使用所述检测方法和/或检测产品发现，l-赖氨酸在类风湿关节炎患者中浓度降低。
5、进一步的，所述检测方法包括高效液相色谱串联质谱法，所述检测产品包括使用高效液相色谱串联质谱法对l-赖氨酸进行检测时所使用的仪器和/或试剂。
6、进一步的，所述高效液相色谱串联质谱法方法包括以下步骤：
7、(1)样本前处理；
8、(2)标准溶液配制；
9、(3)样本检测，其中包括使用agilent 1290 infinity ii series超高效液相色谱仪和装备ajs-esi离子源的agilent 6460三重四极杆质谱仪；
10、(4)校准曲线绘制；
11、(5)样本中目标代谢物浓度计算。
12、进一步的，所述样本源自于血浆。
13、进一步的，所述样本前处理包括提取液提取步骤，所述提取液中甲醇：乙腈＝1：1，-40℃预冷。
14、进一步的，所述标准溶液配置完成得一系列校准溶液，其中l-赖氨酸标准品的浓度依次为100000，50000，25000，12500，6250，3125，1562.5，781.25，390.63，195.31，97.66，48.83，24.41，12.21，6.10，3.05 nmol/l。
15、进一步的，所述样本检测时的高效液相色谱条件为：选用waters acquity uplcbehamide液相色谱柱，100×2.1 mm，1.7μm，waters，a相为10 mm甲酸铵&0.1％甲酸水溶液，b相为乙腈，柱温箱温度为35℃，样品盘设为4℃，进样体积为1μl，流动相梯度洗脱程序如下所示：
16、 time a b flow 0.00min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min 1.00min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min 3.00min 50.00％ 50.00％ 0.350ml/min 4.00min 50.00％ 50.00％ 0.350ml/min 4.50min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min 9.00min 17.00％ 83.00％ 0.350ml/min
17、。
18、进一步的，所述样本检测时的离子源参数为：capillary本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.L-赖氨酸的检测方法和/或检测产品在类风湿关节炎诊断产品制备中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过使用所述检测方法和/或检测产品发现，L-赖氨酸在类风湿关节炎患者中浓度降低。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括高效液相色谱串联质谱法，所述检测产品包括使用高效液相色谱串联质谱法对L-赖氨酸进行检测时所使用的仪器和/或试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本源自于血浆。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本前处理包括提取液提取步骤，所述提取液中甲醇：乙腈＝1：1，-40℃预冷。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述标准溶液配置完成得一系列校准溶液，其中L-赖氨酸标准品的浓度依次为100000，50000，25000，12500，6250，3125，1562.5，781.25，390.63，195.31，97.66，48.83，24.41，
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样本检测时的高效液相色谱条件为：选用Waters ACQUITYUPLC BEHAmide液相色谱柱，100×2.1mm，1.7μm，Waters，A相为10mM甲酸铵&0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈，柱温箱温度为35℃，样品盘设为4℃，进样体积为1μL，流动相梯度洗脱程序如下所示：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样本检测时的离子源参数为：Capillary voltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V，N2 gas temperature＝300℃，N2 gas flow＝5L/min，N2 sheath gas temperature＝250℃，sheath gas flow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
10.一种类风湿关节炎诊断产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1～9任一所述应用中的类风湿关节炎诊断产品。
...【技术特征摘要】
1.l-赖氨酸的检测方法和/或检测产品在类风湿关节炎诊断产品制备中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过使用所述检测方法和/或检测产品发现，l-赖氨酸在类风湿关节炎患者中浓度降低。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括高效液相色谱串联质谱法，所述检测产品包括使用高效液相色谱串联质谱法对l-赖氨酸进行检测时所使用的仪器和/或试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本源自于血浆。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本前处理包括提取液提取步骤，所述提取液中甲醇：乙腈＝1：1，-40℃预冷。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述标准溶液配置完成得一系列校准溶液，其中l-赖氨酸标准品的浓度依次为100000，50000，25000，12500，6250，3125，1562.5，781.25，390.63，195.31，97.66，...
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