一种利用链内核酸自我连接制备单链环状DNA的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用链内核酸自我连接制备单链环状DNA的方法，将待制备成单链环状DNA的核酸先制备成可连接成环的单链DNA分子，在单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰，将修饰后的单链DNA分子进行退火，得到退火产物，退火产物在DNA连接酶的作用下进行连接反应，得到连接产物，采用核酸外切酶处理连接产物中未成环的DNA，然后回收，得到单链环状DNA。该方法可实现环状DNA的高效、大量制备，并且纯度高、成本低，制备的单链环状DNA可以采用滚环扩增技术进行核酸扩增，实现核酸的检测，与现有滚环扩增技术检测核酸方法相比，该方法在核酸检测中可达到更高度灵敏的水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸，具体涉及一种利用链内核酸自我连接制备单链环状dna的方法及应用。

技术介绍

1、滚环复制(环-介导的等温扩增，loop-mediated isothermal amplification-lamp)是具有链置换能力的等温扩增酶利用环状dna分子做模板，进行核酸扩增的方法。该方法与pcr(聚合酶链式反应)都能对微量的核酸模板进行序列特异的扩增，从而实现微量核酸的检测，不同之处在于，滚环复制过程能够在恒定温度下完成扩增反应，因此不需要温控精确的pcr仪，是一种既简便又经济的核酸扩增方法，且不同序列的单链环状dna分子通过滚环复制，能够生成不同长度的串联重复序列。因此，可通过制备单链环状dna分子进行滚环复制，实现核酸的扩增和检测。

2、现有的单链环状dna分子，大多通过酶连反应产生，主要是依赖一段dna(splint)做引导分子，完成目标序列的连接，目标序列与splint之间的相互作用决定了依赖于双分子的连接效率不高，而且这种方法会导致终产物中残留微量引导dna分子，使得后续dna聚合酶利用其作引物进行滚环复制，从而对核酸的结果本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种利用链内核酸自我连接制备单链环状DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述制备成可自我连接成环的单链DNA分子的方法为：人工合成或在引物作用及DNA聚合酶作用下获得；所述在引物作用及DNA聚合酶作用下获得的方法为：

3.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述退火的条件：90℃1分钟，冰上放置2分钟。

4.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，如修饰...

【技术特征摘要】

1.一种利用链内核酸自我连接制备单链环状dna的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状dna的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述制备成可自我连接成环的单链dna分子的方法为：人工合成或在引物作用及dna聚合酶作用下获得；所述在引物作用及dna聚合酶作用下获得的方法为：

3.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状dna的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述退火的条件：90℃1分钟，冰上放置2分钟。

4.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状dna的方法，其特征在于，步骤(2)中，如修饰后的单链dna分子的3’端突出或有缺口序列，则在退火后加入klenow片段或其他具有3’单链外切酶活性的dna聚合酶，以切除突出序列或补平缺口处。

5.如权利要求1所述利用链内核酸自我连接制备单链环状...

【专利技术属性】
技术研发人员：李燕强，韩文灿，郭羽白，宋昱，刘清华，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：