【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及电化学传感，具体涉及一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法。
技术介绍
1、microrna(mirna)是长度为19至25个核苷酸的内源性非编码rna。近年来，研究表明mirna可以充当癌基因或抑癌基因，在细胞分化、增殖、凋亡和细胞转移等癌症发生过程中具有重要作用。此外，mirna还可作为疾病标志物在多种癌症如的早期诊断和预后中发挥作用。血液、细胞、组织等生物样本成分复杂，在对其进行常规的生理生化分析之前通常需要复杂的样品前处理以去除基质干扰。而mirna较为敏感，在前处理过程中容易破碎，需要进行更加精细复杂的前处理，这无形中提高了分析的人力物力成本，延长了检测的时间。因此有必要开发更加便捷、灵敏的mirna分析方法。
2、目前对mirna进行分析的方法主要有rt-pcr、电化学、电化学发光、荧光等，其中电化学发光结合了电化学和化学发光的原理，是指在电极上施加电压产生电生物质，电生物质之间或电生物质与其他物质之间发生进一步反应产生的化学发光现象。在此过程中，电信号转化为光信号，并且结合了电化学和化学发光的优势，因此，该方法具有灵敏度高、背景低、成本低等优势，近年来在医学诊断、食品分析、环境监测等领域得到广泛应用。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，该方法可以实现对血液或组织中疾病标志物mirna含量的检测，并且该方法灵敏度高，检
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，包括以下步骤：
4、s1.将待测样品进行超支化滚环扩增，得到扩增液；
5、s2.向所述扩增液中加入发光体进行反应，得到反应液；然后将反应液稀释，并加入共反应剂，得到待测液；
6、s3.以所述待测液作为电解液，将工作电极、对电极以及参比电极置于所述电解液中，使用循环伏安法施加电压，获得电化学发光信号强度ecl1；再以空白样品作为电解液，按照同样的方法，获得电化学发光信号强度ecl0；则待测样品的电化学发光信号强度的绝对值δecl＝|ecl1-ecl0|；
7、s4.根据工作曲线及δecl，计算出待测样品中疾病标志物hsa-mirna-10a-5p的含量；
8、其中，步骤s3中，所述工作电极为修饰有垂直有序介孔二氧化硅的电极。
9、本专利技术步骤s1中，所述待测样品可为裂解后的血液样品或组织样品，无需其他前处理，取样和制样十分简单，成本低。
10、本专利技术步骤s1中，采用超支化滚环扩增对样品中的mirna进行信号放大。该mirna为hsa-mirna-10a-5p，其是急性髓系白血病疾病标志物。对于hsa-mirna-10a-5p含量的检测，可用于对急性髓系细胞白血病、膀胱癌等疾病的诊断。
11、mirna在生物样本中含量较低，难以利用电化学发光等方法直接进行分析，因此需借助一定的手段对其进行信号放大。目前常用的核酸信号放大技术主要有杂交链式反应、环介导等温扩增、滚环扩增、超支化滚环扩增、连接酶链反应等。其中，超支化滚环扩增能够输出大量的树枝状双链dna(dsdna)，能够与发光分子ru(phen)32+结合形成复合物。因此，本专利技术中利用此原理，采用超支化滚环扩增对样品中的mirna进行信号放大，再利用电化学发光的方法，依靠发光分子ru(phen)32+对目标mirna进行信号强度表征。
12、进一步地，所述超支化滚环扩增包括以下步骤：
13、a.将待测样品、锁式探针、dna连接酶、dna连接酶缓冲液混合，进行连接反应，反应结束后对酶进行灭活；
14、b.向步骤a的体系中加入核酸外切酶i和核酸外切酶iii，进行酶切反应，反应结束后对酶进行灭活；
15、c.向步骤b的体系中加入dna聚合酶、引物1、引物2、dna聚合酶缓冲液和dntp，进行滚环扩增反应，反应结束后对酶进行灭活；
16、上述超支化滚环扩增过程中，锁式探针序列为：5'-p-gatctacagggtaatcccttcgacgtacgctacgcctccaaccacacacaaattcg-3'，引物1序列为：5'-gtacgctacgcctcca-3'，引物2序列为：5'-gtcgaagggat-3'。
17、上述超支化滚环扩增过程中，使用的dna连接酶可为e.coli dna连接酶或t4 dna连接酶，优选为e.coli dna连接酶；使用的dna聚合酶可为bst dna聚合酶或phi29 dna聚合酶，优选为bst dna聚合酶。
18、上述步骤a中，对锁式探针进行连接反应的反应时间可为0.5～3h，例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h等，优选为1h。连接反应的温度可为10～37℃，例如10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃等，优选为16℃。
19、上述步骤b中，使用核酸外切酶i和核酸外切酶iii进行酶切反应的时间可为0.5～4h，例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等，优选为1h。酶切反应的温度可为20～45℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃等，优选为37℃。
20、上述步骤c中，超支化滚环扩增反应的时间可为0.5～3h，例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h等，优选为2h。超支化滚环扩增反应的温度可为45～65℃，例如45℃、50℃、55℃、60℃、65℃等，优选为63℃。
21、本专利技术步骤s2中，在超支化滚环扩增结束后，向扩增液中加入发光体ru(phen)32+，ru(phen)32+可以与扩增产物发生反应，形成复合物。
22、超支化滚环扩增会产生大量的双链dna(dsdna)，而发光分子ru(phen)32+可以嵌入双链dna(dsdna)的凹槽中，形成复合物，该反应具有很强的特异性。在超支化滚环扩增的过程中，对锁式探针进行连接后，会加入核酸外切酶i和核酸外切酶iii，将体系中未反应的核酸引物以及样本中的其他dna剪切掉(无法剪切环dna)，随后进行后续的扩增步骤。后续步骤中存在多次加热对酶灭活的操作，若存在rna类杂质，亦会高温分解(rna不稳定)。因此，在超支化滚环扩增反应结束后，样品中的其他dna物质理应是不存在的，故不会产生干扰。即使仍存在少量的其他核酸类物质，也只有dsdna会对实验产生干扰，其含量也是极其少的，最终体系中大部分是扩增所产生的dsdna。综上，经过超支化滚环扩增后，样品中的其他dna物质不会产生干扰，从而保证本专利技术的检测方法具有较高的灵敏度和稳定性。
23、本专利技术中，发光体ru(phen)32+的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样品为裂解后的血液样品或组织样品；和/或，
3.根据权利要求2所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤a中，所述连接反应的时间为0.5～3h，温度为10～37℃；和/或，
4.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述发光体包括Ru(phen)32+；和/或，
5.根据权利要求4所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤S2中，向扩增液中加入发光体使其浓度为0.01～0.5mM；所述反应的时间为5～180min；和/或，
6.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRN
7.根据权利要求6所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤d中，所述电极为氧化铟锡或掺氟氧化锡电极；和/或，
8.根据权利要求6所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤f中，所述酸处理采用盐酸-乙醇溶液，其pH为1～6；所述酸处理的时间为0.5～30min。
9.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤S3中，在进行检测前，先静置富集10～60s；和/或，
10.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-miRNA-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤S4中，所述工作曲线的制作方法为：
...【技术特征摘要】
1.一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤s1中，所述待测样品为裂解后的血液样品或组织样品；和/或，
3.根据权利要求2所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤a中，所述连接反应的时间为0.5～3h，温度为10～37℃；和/或，
4.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤s2中，所述发光体包括ru(phen)32+；和/或，
5.根据权利要求4所述的一种基于电化学发光检测疾病标志物hsa-mirna-10a-5p含量的方法，其特征在于，步骤s2中，向扩增液中加入发光体使其浓度为0.01～0.5mm；所述反应的时间为5～180min；和/或，
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【专利技术属性】
技术研发人员：王伟佳，王娟，刘静，洪明，董谦，
申请(专利权)人：中山市人民医院，
类型：发明
国别省市：
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