一种注射用交联胶原蛋白制备方法技术

技术编号：42695279 阅读：65 留言：0更新日期：2024-09-13 11:52

本发明专利技术公开了一种注射用交联胶原蛋白制备方法，属于胶原蛋白技术领域，采用重组人源化III型胶原蛋白和牛I型胶原蛋白高温下密闭交联反应，得到无菌的注射用交联胶原蛋白。筛选耐热性好的重组人源化III型胶原蛋白，将其和牛I型胶原蛋白按照1:5.5混合，更接近人体皮肤组织中胶原蛋白的组成配比，密闭条件下配制胶原蛋白溶液，并添加交联剂于50℃下进行交联反应，利用高温条件促进交联剂挥发，反应过程中排气去除交联剂。反应过程在密闭条件下进行，有效防止微生物污染，投入灭菌注射用水进一步抑菌，得到交联剂残留量小、无微生物污染的注射用交联胶原蛋白。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于胶原蛋白，具体涉及一种注射用交联胶原蛋白制备方法。

技术介绍

1、随着基因工程技术的广泛应用，通过采用合适的工程菌株(大肠杆菌、毕赤酵母等)外源性表达人胶原蛋白，成功地解决了人胶原蛋白大规模制备的瓶颈问题。但是，利用工程菌株例如毕赤酵母基因工程菌株表达人胶原蛋白时，人胶原蛋白会在发酵、纯化及保存过程中发生降解，这增加了生产成本，并且影响了这种方法生产的人胶原蛋白的性能。

2、推测人胶原蛋白发生降解的原因可能是其氨基酸序列中含有较多的易发生水解的位点。因此，技术人员通过选择来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列进行重复来构建重组胶原蛋白，以期回避易发生水解的位点，从而提高胶原蛋白的稳定性，同时还能保持天然人胶原蛋白的优良性能。但是，通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白，其氨基酸组成及分布都相对单调，理论上讲，这会造成其表面的电荷负载大，整体不容易达到稳定的平衡状态，因而在水溶液中容易水解、变性，且存在短氨基酸序列重复单元越短、重复次数越多，重组胶原蛋白分子在水溶液中越不稳定。

3、天然人胶原蛋白的单链分子量约为110-130kd，从实用性的观点出发，技术人员普遍认为适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白的分子量需要达到100kd以上。然而，天然的人胶原蛋白来源受限，动物源胶原蛋白存在传播疾病的风险，基因工程表达的人胶原蛋白容易在发酵、纯化及保存过程中发生降解。因此，如何获得兼具天然人胶原蛋白的稳定性和重组胶原蛋白的低成本工程材料的胶原蛋白成为本
的限制性问题。</p>

4、本领域技术人员通过交联来提升胶原蛋白的力学性能和延长其在体内的降解时间。但是对于胶原蛋白注射液产品而言，交联所使用的交联剂最终会随胶原蛋白一起进入并长期存在于人体中，这些交联剂会对人体产生毒性。这种情况下，本领域技术人员期望找到合适的交联胶原蛋白制备工艺，使得反应简单易行、交联效率高且能够通过简单的操作基本上完全除去交联剂。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提供一种注射用交联胶原蛋白制备方法，以解决胶原蛋白交联剂难以去除的问题。

2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：

3、本专利技术提供一种注射用交联胶原蛋白制备方法，包括以下步骤：

4、(1)50℃水浴6h条件下筛选耐热性好的重组人源化iii型胶原蛋白，通过sds-page凝胶电泳分析重组人源化iii型胶原蛋白降解情况，筛选出降解程度最低的作为本产品的主要原材料；

5、(2)将耐热性好的重组人源化iii型胶原蛋白和牛i型胶原蛋白混合，得到混合胶原蛋白；

6、(3)密闭条件下向反应器中添加混合胶原蛋白和缓冲液，搅拌混匀得到胶原蛋白溶液；

7、(4)密闭条件下向反应器中加入交联剂，加热至50℃搅拌进行交联反应，反应过程中持续排气，反应结束后得到交联胶原蛋白凝胶；

8、(5)密闭条件下向反应器中加入灭菌注射用水，35℃下搅拌使交联胶原蛋白凝胶吸水膨胀得到注射用交联胶原蛋白。湿热灭菌胶原蛋白在高温下会发生变性，辐照灭菌的放射性会导致蛋白质结构发生变化，环氧乙烷灭菌仅适用于物体表面的灭菌，均不适用于此类产品。此类产品只能通过过程无菌进行生产，加入灭菌注射用水，适用于注射用产品灭菌，而本专利技术中产品制备的过程在密闭环境中进行，减少了微生物污染的机会。

9、进一步地，所述重组人源化iii型胶原蛋白和牛i型胶原蛋白混合的比例为1:5.5。

10、进一步地，所述缓冲液为0.2m的pbs缓冲液，其中nacl占比为1.2wt％，缓冲液ph为7.0。

11、进一步地，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为60mg/ml。

12、进一步地，所述混合胶原蛋白和缓冲液搅拌时长为6h，搅拌转速为60r/min，搅拌温度为35℃。

13、进一步地，所述交联剂为戊二醛和0.2m pbs缓冲液的混合溶液，其中戊二醛占比为0.05wt％，nacl占比为1.2wt％，混合溶液ph为7.0。

14、进一步地，所述交联胶原蛋白凝胶中胶原蛋白浓度为50mg/ml。

15、进一步地，所述交联反应的反应时间为12h，搅拌转速为60r/min。

16、进一步地，所述灭菌注射用水添加量为交联胶原蛋白凝胶体积的40％。

17、进一步地，所述灭菌注射用水加入后搅拌时长为12h，搅拌转速为60r/min。

18、本专利技术的有益效果：

19、(1)筛选耐热性较好的重组人源化iii型胶原蛋白，使得交联反应可以在较高温度进行，有利于交联剂的挥发，交联剂的残留量更低，且使得交联反应更加充分进行，去除交联剂的反应过程简单易操作。

20、(2)在密闭的情况下完成胶原蛋白溶液的配制和交联反应，降低了环境微生物污染的可能，通过添加灭菌注射用水，保证交联胶原蛋白无菌同时更加适合于注射用产品的制备。

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【技术保护点】

1.一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述重组人源化III型胶原蛋白和牛I型胶原蛋白混合的比例为1:5.5。

3.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述缓冲液为0.2M的PBS缓冲液，其中NaCl占比为1.2wt％，缓冲液pH为7.0。

4.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为60mg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述混合胶原蛋白和缓冲液搅拌时长为6h，搅拌转速为60r/min，搅拌温度为35℃。

6.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛和0.2M PBS缓冲液的混合溶液，其中戊二醛占比为0.05wt％，NaCl占比为1.2wt％，混合溶液pH为7.0。

7.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述交联胶原

8.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述交联反应的反应时间为12h，搅拌转速为60r/min。

9.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述灭菌注射用水添加量为交联胶原蛋白凝胶体积的40％。

10.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述灭菌注射用水加入后搅拌时长为12h，搅拌转速为60r/min。

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【技术特征摘要】

1.一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述重组人源化iii型胶原蛋白和牛i型胶原蛋白混合的比例为1:5.5。

3.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述缓冲液为0.2m的pbs缓冲液，其中nacl占比为1.2wt％，缓冲液ph为7.0。

4.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为60mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种注射用交联胶原蛋白制备方法，其特征在于，所述混合胶原蛋白和缓冲液搅拌时长为6h，搅拌转速为60r/min，搅拌温度为35℃。

6.根据权利要求1所述的一种注射用...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄希文，李晶晶，张成绪，
申请(专利权)人：安徽润朗集录生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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