【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学分离(ipc分类号：c12q)，尤其涉及一种生医分离用光响应dna微球的制备方法及应用。
技术介绍
1、mrna可以广泛用于分子生物学的各种下游实验中，例如rt-pcr、cdna文库的构建、northern blot分析、cdna微阵列、亲和纯化、引物延伸、消减杂交引物延伸、race(rapid-amplification of cdnaends通过pcr进行cdna末端快速克隆)、基因表达分析等方向。而如何对mrna进行高效、准确的提取，成为了生医分离领域仍在探究的课题。
2、在目前的分离提取方法中，磁珠表面共价偶联oligo(dt)越来越受到关注，通过磁珠表面共价偶联修饰，能够与真核生物mrna尾部的poly a互补配对，从而高效地从真核生物总rna或直接从动植物组织或细胞裂解物中快速分离出完整、高纯度的mrna。而其他rna种类(rrna和trna)不包含poly a序列，因此不会与oligo(dt)磁珠结合。磁珠表面共价偶联方法具有捕获效率高、使用方便等特点；但实际应用时，对于目标物质的特异性识别仍有待提升，加热洗脱、多次洗涤引入杂质甚至破坏目标物质的影响难以消除。
3、中国专利cn112126643b公开了一种基于磁珠分离外泌体中ecdna的方法，通过磁珠法高选择性地分离外泌体中ecdna，无需使用超速离心等复杂操作，也避免使用氯化铯等有毒试剂，能够适应自动化操作分离得到较高纯度ecdna产物。中国专利cn114196668a公开了一种用于捕获poly a(+)rna的磁珠
技术实现思路
1、本专利技术人在先研究发现一种偶氮苯光敏单体，能够插入任意dna序列任意位置得到掺杂偶氮苯的光敏dna(kou b,guo x,xiao s,et al.highly efficient room-temperature photoresponsive dna tethering azobenzene through backbone-inserted glycerol via ether bond[j].small,2013,9(23):3939-3943)。光敏dna在可见光下可与序列互补的天然dna链、rna链杂交，也能正常与相应特定蛋白和酶作用；紫外光照后双链打开，生物功能消失；由此可实现目标物质的提取与分离。在这样的思路下，如将光敏dna修饰在微球表面，可得到光响应分离用微球，除具备正常表面功能化微球性能外，还增加了光控分离、可重复使用等功能，具备简化操作步骤、节约试剂消耗、节能安全无污染等特点，可用于药物筛选、生物医用分子分离提纯、医疗检测等领域。本申请旨在将微球分离和光控dna双链解链相结合，为生医分离提供一种全新的实践思路。
2、光敏dna最早是由日本合成(asanuma h,liang x,nishioka h,et al.synthesisof azobenzene-tethered dna for reversible photo-regulation of dna functions:hybridization and transcription[j].nature protocols.2007,2(1):203-212.)，但其光控效率低，无法完成光洗脱。另外日本合成的光敏dna价格高昂，限制了应用推广。本申请改进合成的光敏解链dna与日本相比，光控效率至少提高30％，成本至少降低50％，使得光洗脱产业化未来可期，实用价值高。
3、本专利技术第一方面提供了一种生医分离用光响应dna微球的制备方法，制备步骤包括：
4、(1)取掺杂偶氮苯的dna分子配制光敏dna溶液；
5、(2)取表面修饰nhs基团的微球或磁珠，清洗后富集；
6、(3)将光敏dna溶液与nhs修饰微球混合，制备光响应dna微球。
7、(4)对光响应dna微球进行封闭、洗涤，溶于缓冲溶液备用。
8、参见图1，本项技术将掺杂偶氮苯序列的光敏dna链与表面带有nhs酯官能团的微球以共价键连接，用于分离提纯目标溶液中的特定物质。所得光响应dna微球结构中，光敏dna链位于微球的表面，通过序列设计可与目标物质产生“特异性结合”。通过优化操作工艺，可提升光敏dna链和微球的结合率，进一步提高光响应dna微球的提取效率。
9、优选的，所述步骤(1)具体为，用nahco3溶液(100-300mm)溶解氨基修饰的偶氮苯掺杂光敏dna分子(专利技术人提供光敏单体，设计光敏3’nh2-或5’nh2-光敏dna序列，交由引物合成公司代合成)，配置光敏dna溶液。所述光敏dna溶液中光敏dna分子的浓度为0.1-10mg/ml。
10、优选的，所述步骤(2)具体为，将表面修饰nhs基团的微球悬浮液(1～20mg/ml)加入带盖塑料离心管(下称ep管)中富集去除上清液(普通微球采用高速离心机，磁珠采用磁性分离架富集分离)。然后加入0.1-1.5mm的盐酸水溶液于ep管中，清洗富集去除上清液备用。
11、优选的，所述步骤(3)具体为，向ep管中加入步骤(1)制备得到的光敏dna溶液，涡旋10-60s混合均匀；将ep管置于垂直混合仪上，室温混合0.5-4h后富集微球。
12、为了促进光敏dna链和微球的结合效果，进一步优选的，所述步骤(3)具体为，向ep管中加入步骤(1)制备得到的光敏dna溶液，涡旋30s混合均匀；将ep管置于垂直混合仪上，室温混合1～2h，每隔15min，取下ep管涡旋15s后富集。
13、优选的，所述步骤(4)具体为，向ep管中加入封闭缓冲液(100mm tris-hcl,150mmnacl,ph 8.0)进行涡旋，将ep管置于垂直混合仪中室温反应2h。然后富集弃上清液。加入超纯水，洗涤富集弃上清液。加入te缓冲液(10mm tris-hcl,1mm edta,ph 7.5)于ep管中，富集上清液2次，加入te缓冲液配制1～20mg/ml的光响应dna微球，4℃保存备用。进一步优选的，所得光响应dna微球的浓度为5～10mg/ml。
14、本专利技术第二方面提供了一种如上所述光响应dna微球的制备方法在生物医用分子分离提纯中的应用。所述生物医用分子包括dna，rna，蛋白质，酶等能够与天然dna结合的物质。所述光响应dna微球的应用方法具体为：
15、s1.将光响应dna微球富集洗涤后悬浮于结合缓冲液；
16、s2.将生物样本加入到光响应磁珠悬浮液中进行孵育，使目标物质与光响应dna微球相结合，得到目标物质-微球结合物；
17、s3.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生医分离用光响应DNA微球的制备方法，其特征在于，所述光响应DNA微球的制备步骤包括：
2.根据权利要求1所述的生医分离用光响应DNA微球的制备方法，其特征在于，所得光响应DNA微球的浓度为1～20mg/mL；优选的，混合后光响应DNA微球的浓度为5～10mg/mL。
3.一种根据权利要求1或2所述光响应DNA微球的制备方法的应用，其特征在于，可应用于生物医用分子的分离提纯领域。
4.根据权利要求3所述光响应DNA微球的制备方法的应用，其特征在于，所述生物医用分子为可与天然DNA结合的生物医用分子，包括DNA，RNA，蛋白质，酶。
5.根据权利要求4所述光响应DNA微球的制备方法的应用，其特征在于，所述光响应DNA微球的应用方法具体为：
6.根据权利要求5所述光响应DNA微球的制备方法的应用，其特征在于，所述步骤S3洗脱纯化步骤是通过紫外光洗脱得到。
7.根据权利要求6所述光响应DNA微球的制备方法的应用，其特征在于，所述紫外光洗脱，可以使用的光源包括紫外灯管、LED光源或氙灯光源及滤光片组合，照射时
8.根据权利要求5所述光响应DNA微球的制备方法的应用，其特征在于，洗脱纯化分离后的光响应DNA微球可以进行再生利用；所述再生方法为，取步骤S3分离后的光响应DNA微球，洗涤后通过可见光照射进行再生处理；处理后的光响应DNA微球能够再次重复S1～S3步骤，从而实现循环使用。
9.一种根据权利要求1或2所述光响应DNA微球的制备方法在药物筛选、基因测序、医疗检测领域的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种生医分离用光响应dna微球的制备方法，其特征在于，所述光响应dna微球的制备步骤包括：
2.根据权利要求1所述的生医分离用光响应dna微球的制备方法，其特征在于，所得光响应dna微球的浓度为1～20mg/ml；优选的，混合后光响应dna微球的浓度为5～10mg/ml。
3.一种根据权利要求1或2所述光响应dna微球的制备方法的应用，其特征在于，可应用于生物医用分子的分离提纯领域。
4.根据权利要求3所述光响应dna微球的制备方法的应用，其特征在于，所述生物医用分子为可与天然dna结合的生物医用分子，包括dna，rna，蛋白质，酶。
5.根据权利要求4所述光响应dna微球的制备方法的应用，其特征在于，所述光响应dna微球的应用方法具体为：
6.根据权利要求5所述光响应d...
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