【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原菌检测，更具体的说是涉及同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr引物探针及试剂盒。
技术介绍
1、柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,hlb)是一类由寄生在韧皮部的革兰氏阴性菌韧皮部杆菌引起的柑橘类植物病害，能够侵染柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科柑橘亚科的近缘属植物，严重影响柑橘类水果的品质和产量，每年在全球范围内造成数十亿美元的经济损失。根据病原核酸序列的不同以及对热的敏感性、传播虫媒和地理分布不同，分为亚洲种(candidatus liberibacter asiaticus,las)、非洲种(ca.l.africanus,laf)和美洲种(ca.l.americanus,lam)。las至今无法在人工培养基上培养，苗木一旦感染将无药可治；因此，加强病害的诊断和检测技术研究就显得尤为重要。柑橘溃疡病菌(xanthomonas citripv.citri，xcc)是国内外重要的检疫性有害生物，引起柑橘溃疡病。柑橘溃疡病在我国柑橘产区均有发生，在湖南、浙江、福建、云南、江西、广西、广东、贵州等南方柑橘种植省区发生较为普遍。柑橘感染溃疡病菌后，在叶、枝、果实上形成火山口状的病斑，后期可造成落叶、落果，严重影响柑橘果实的产量和品质。
2、双重pcr是在同一反应体系中同时加入两对引物，实现多个基因、多种病原同时扩增的技术，具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点。据报道，目前已有研究者建立了柑橘黄龙病菌亚洲种和溃疡病菌双重pcr检测方法，
3、因此，提供同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr引物探针及试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr引物探针及试剂盒，实现快速、灵敏、高效地同时检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌。
2、建立稳定、可靠的同步检测上述两种病原的双重实时荧光pcr检测技术体系，对于田间病情调查与监测、苗圃病原快速鉴定及无毒苗木快速检测具有重要的意义。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr引物探针，
5、用于柑橘黄龙病菌亚洲种检测的引物探针序列如下：
6、上游引物hlb-f1：5’-cgggataacgcatggaaac-3’；seq id no.1；
7、下游引物hlb-r1：5’-aatccaacgcaggctcatct-3’；seq id no.2；
8、探针hlb-p1：5’-ctaataccgtatacgccc-3’；seq id no.3；
9、探针hlb-p15’端修饰荧光报告基团fam，3’端修饰淬灭基团bhq1；
10、用于柑橘溃疡病菌检测的引物探针序列如下：
11、上游引物xcc-f：5’-gtttcgtcgatgccctcat-3’；seq id no.4；
12、下游引物xcc-r：5’-cgacttgccgctgagatt-3’；seq id no.5；
13、探针xcc-p：5’-ctgggcattggacagcaagttgttc-3’；seq id no.6；
14、探针5’端修饰荧光报告基团vic，3’端修饰淬灭基团bhq1。
15、进一步，同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr检测试剂盒，包括所述的双重实时荧光pcr引物探针。
16、进一步，同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr检测方法，包括以下步骤：
17、(1)待测植物样品dna的提取；
18、(2)使用所述的双重实时荧光pcr引物探针对步骤(1)所得dna模板进行实时荧光pcr扩增，得到扩增曲线；pcr扩增的反应体系为：共20μl，2xaccurate taq hs probepremix(ung plus)10μl，10μm的探针hlb-p1和xcc-p各0.8μl，10μm的引物hlb-f1、hlb-r1、xcc-f、xcc-r各0.4μl，样品dna 1μl，ddh2o补足至20μl；
19、(3)实时荧光pcr扩增的程序为两步法pcr反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环；从60℃步骤开始收集荧光信号；
20、(4)对扩增曲线进行分析判断的原则为：
21、当fam荧光通道中ct≤35时，荧光通道有明显“s”型扩增曲线时，判断样品为柑橘黄龙病菌亚洲种阳性；
22、当fam荧光通道中35<ct≤40时，荧光通道有“s”型扩增曲线时，重复一次实验，如果fam荧光通道ct还是在此范围之内或小于等于35，判断样品为柑橘黄龙病菌亚洲种阳性，否则判断样品为柑橘黄龙病菌亚洲种阴性；
23、当fam荧光通道中ct>40时，判断样品为柑橘黄龙病菌亚洲种阴性；
24、当vic荧光通道中ct≤35时，荧光通道有明显“s”型扩增曲线时，判断样品为柑橘溃疡病菌阳性；
25、当vic荧光通道中35<ct≤40时，荧光通道有“s”型扩增曲线时，重复一次实验，如果vic荧光通道ct还是在此范围之内或小于等于35，判断样品为柑橘溃疡病菌阳性，否则判断样品为柑橘溃疡病菌阴性；
26、当vic荧光通道中ct>40时，判断样品为柑橘溃疡病菌阴性。
27、本专利技术首次设计了同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重pcr检测引物和探针组合物；首次建立了一种同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重pcr检测方法；首次研发出可同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr快速检测试剂盒。
28、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr引物探针及试剂盒，具有以下有益效果：(1)高效，本专利技术方法能够在同一反应体系中同时检测柑橘植株上两种病原，大大提高了检测效率。(2)快速，在同时检测两种病原的同时节约了检测时间，一般的普通pcr检测方法时间在3个小时以上，本专利技术将检测时间缩短至1个小时以内，而且可以直接通过软件分析检测结果，不用经过电泳等步骤，对检测人员无毒害。(3)灵敏，经实验证实，本专利技术建立的检测方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光PCR引物探针，其特征在于，
2.同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的双重实时荧光PCR引物探针。
3.同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr引物探针，其特征在于，
2.同步检测柑橘黄龙病菌亚洲种和柑橘溃疡病菌的双重实时荧光pcr检测试剂盒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟桂萍，闫晓东，吉前华，许然，胡加谊，郭丽英，蒋惠，
申请(专利权)人：黄埔海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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