【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于小胞外囊泡检测，具体涉及基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器及其应用。
技术介绍
1、目前癌症的诊断技术主要包括肿瘤标志物检测、计算机断层摄影和组织活检。组织活检是癌症诊断的金标准，然而，组织活检不能很好的监测肿瘤的动态进展，这种侵袭性方法还可能增加肿瘤转移的可能性，导致生存和预后差。液体活检是一种非侵入性的检测技术，在肺癌早筛中具有很大的优势，由于其侵袭小、操作方便、可多次获取等优点受到了广泛关注，为癌症诊断和实时监测提供了更多的机会。
2、小胞外囊泡(small extracellular vesicles，sevs)是指体液中的纳米级(30～200nm)细胞外囊泡。与ctcs和ctdna相比，sevs在液体活检中表现出更大的优势：含量高；含有丰富的可检测靶标；稳定性好；时效性强。肿瘤细胞每天可以分泌约104个sevs，高于正常细胞。越来越多的证据表明肿瘤患者体液中的sevs含量显著升高，尤其是肿瘤相关蛋白表达阳性的sevs，如上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)或程序性细胞死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)表达阳性sevs。然而，体液环境复杂，其中含有脂蛋白、蛋白聚集体等多种与sevs尺寸或密度具有相似性的物质。同时，sevs体积极小，且在粒径及生物化学成分方面存在异质性，故sevs的检测难度很大。现有sevs检测方法存在以下两方面局限性：①采
3、与单信号输出模式相比，双信号输出模式采用两种不同的响应机制，通过两个独立信号之间的自我验证，可以将环境差异带来的信号值变化归一化，从而有效地消除系统干扰，极大提高分析测量的准确性、可靠性和可重复性；同时，基于双信号输出模式的双模传感器还具有每种响应模式的固有特征和优点，两种信号输出在灵敏度和检测线性范围等方面的差异，使双模传感器能够满足不同的检测要求，扩大了传感器的适用范围。鉴于上述优点，已有双模式传感技术被开发用于食品安全和临床诊断等领域。在双模传感器的众多检测模式中，比色法是应用最广的方法之一。该方法主要通过肉眼比较有色物质溶液颜色深度或分光光度计测量溶液吸光度来确定待测组分含量，具有可视化、不需要复杂的大型仪器设备和操作简便等优点，但其也存在着灵敏度较低的局限性。化学发光分析法是根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中待测组分含量的分析方法，具有灵敏度高、仪器简单等优点，在分析化学和医学诊断中有着广泛的应用，可有效弥补比色法灵敏度的不足。综上，将比色和化学发光两种模式相结合，相互验证，有助于提高检测准确性。
4、由于癌症早期体液中肺癌相关蛋白阳性sevs含量较低，故对检测方法的灵敏度要求极高。规律成簇间隔短回文序列(clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats，crispr)及crispr相关蛋白(crispr-associated protein，cas)系统(crispr/cas)也被称为“基因魔剪”，能精准靶向目标核酸实现定点切割，分辨率高达单个碱基，且易于编程设计改造，在基因编辑和生物传感领域应用前景广阔。其中，crispr/cas12a与目标dna结合后，不仅会顺式切割目标dna，还具有与序列无关的脱氧核糖核酸酶活性，能对非目标ssdna进行反式切割，极大提高检测灵敏度。杂交链式反应(hybridization chain reaction，hcr)是常用的恒温无酶的核酸扩增策略，可由触发链引发若干自身稳定的dna茎环结构发生级联反应产生具有切口的长链dna结构，将其与crispr/cas12a系统串联，有望实现一个目标物激活多个cas12a蛋白，从而级联放大检测信号。此外，酶具有高效、专一、环保的优点，已广泛应用于生物传感器中。采用酶替代传统的荧光分子作为crispr/cas12a系统中的信号报告分子，cas12a反式切割释放出酶并催化底物产生检测信号，有望有效克服常规荧光报告探针的缺陷，实现一次反式切割产生大量信号分子，从而极大提高检测灵敏度。
技术实现思路
1、本专利技术以检测epcam+sevs为例，利用核酸适配体(aptamer，apt)和双胆固醇探针(double cholesterol anchor，dc-anchor)双重识别目标sevs，提高检测的特异性和准确性，并避免体液中可溶性蛋白的干扰；运用磁分离技术实现sevs分离富集；联合运用crispr/cas12a、hcr和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)多重放大检测信号，大幅提高检测灵敏度；结合化学发光和比色双模式信号进行相互验证，提高检测准确性、可靠性和适用范围；最终建立一种灵敏度高、特异性强、准确性好的sevs双模式检测方法。
2、本专利技术具体采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，该传感器包括：
4、捕获磁珠、双胆固醇探针、发夹探针h1和h2、链霉亲和素、cas12a、crrna、crispr/cas12a激活链(activator)、催化磁珠、elisa显色液、化学发光底液；
5、所述捕获磁珠上偶联有肿瘤特异性蛋白适配体，肿瘤特异性蛋白如上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)、程序性细胞死亡配体1(programmedcell death1ligand 1，pd-l1)；
6、所述双胆固醇探针由胆固醇探针a1和a2配制而成，在进一步的方案中，a1和a2的摩尔比为1:1；所述胆固醇探针a1的3’端和胆固醇探针a2的5’端均带有生物素标记；
7、双胆固醇探针能结合小胞外囊泡，且其粘性末端作为触发链能与h1杂交，打开h1发夹结构，h1新暴露出的序列能与发夹探针h2杂交，打开h2发夹结构，触发杂交链式反应；所述发夹探针h1的3’端和发夹探针h2的5’端均带有生物素标记；
8、所述催化磁珠上偶联有辅助链和t-hrp链，催化磁珠上的催化剂能催化不同底物产生比色和化学发光两种检测信号。
9、在进一步的方案中，上皮细胞粘附分子适配体的序列如seq id no:1所示；程序性细胞死亡配体1适配体的序列如seq id no:2所示；
10、胆固醇探针a1和a2的序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示；
11、发夹探针h1和h2的序列分别如seq id no:5和seq id no:6所示；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，肿瘤特异性蛋白为上皮细胞粘附分子或程序性细胞死亡配体1。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，所述双胆固醇探针由胆固醇探针A1和A2配制而成，A1和A2的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，上皮细胞粘附分子适配体的序列如SEQ ID NO:1所示；程序性细胞死亡配体1适配体的序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，胆固醇探针A1和A2的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求1所述的基于CR
7.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，
8.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，
9.权利要求1～8任一项所述的基于CRISPR/Cas12a和HCR的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器在制备检测sEVs的试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，肿瘤特异性蛋白为上皮细胞粘附分子或程序性细胞死亡配体1。
3.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，所述双胆固醇探针由胆固醇探针a1和a2配制而成，a1和a2的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，上皮细胞粘附分子适配体的序列如seq id no:1所示；程序性细胞死亡配体1适配体的序列如seq id no:2所示。
5.根据权利要求3所述的基于crispr/cas12a和hcr的小胞外囊泡比色/化学发光双模式传感器，其特征在于，胆固醇探针a1和a2的序列分别如seq id no:3和...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁丽华，吴拥军，吴艳，刘利娥，何磊良，杨瑞英，玉崧成，王艺琳，章嫒嫒，申浩宇，王彭彭，杜玉慧，杜雪倩，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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