【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，属于中药领域。
技术介绍
1、马齿苋为马齿苋科植物马齿苋portulaca oleracea的干燥地上部分，酸，寒。归肝、大肠经。具有清热解毒，凉血止血，止痢功效。用于热毒血痢，痈肿疔疮，湿疹，丹毒等，对马齿苋药品市场调研及文献检索，发现马齿苋常见的伪品主要为花卉植物太阳花的干燥地上部分，对太阳花进行its条形码序列扩增后在ncbi中进行比对，其基原为马齿苋同属植物毛马齿苋portulaca pilosa，除此之外，少见伪品为菊科植物墨旱莲与鼠曲草、景天科植物垂盆草与佛甲草、鸭跖草科植物鸭跖草，因此，亟需建立一种鉴别方法，对市场上马齿苋和毛马齿苋及其他伪品进行区分。对于提升马齿苋药材标准、质量控制和确保临床准确、安全用药具有重要的实际意义。
2、多重pcr是一种分子鉴定技术，该方法是将多对引物添加到同一反应体系中各自扩增对应的dna片段的技术，相对于普通pcr具有节省检测时间，节省试剂等优点，且不受药材形状影响，能够检测少量掺伪，客观性强、不依赖主观判断。目前已经应用于多个中药品种的鉴定研究中，如地龙(田娜,魏艺聪,袁媛,等.地龙的多重位点特异性pcr鉴别[j].中国实验方剂学杂志,2019,25(17):124-129.)、海马(刘富艳,袁媛,金艳,等.多重pcr同时鉴别5种药用海马[j].中国中药杂志,2018,43(23):4562-4568.)、石斛(罗宇琴,蒋超,袁媛,等.多重位点特异性pcr鉴别霍山石斛、铁皮石斛与齿瓣石斛药材[j].
3、经文献查阅，暂未发现关于马齿苋与毛马齿苋及其他伪品的多重pcr鉴别方法。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供一种dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用。本专利技术的第二目的是提供一种基于上述dna条形码序列的基因位点设计的多重pcr方法。
2、技术方案：本专利技术所述dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，所述dna条形码为细胞核基因its条形码，其序列的genbank登陆号为mt923439.1，当细胞核基因its条形码序列的第490-491位核苷酸为cc、第605位核苷酸为a时，待测药材为马齿苋；当细胞核基因its条形码序列的第490-491位核苷酸为tt、第605位核苷酸为t时，待测药材为毛马齿苋。
3、其中，所述dna条形码为叶绿体基因matk条形码，其序列的genbank登陆号为mh037654.1，当叶绿体基因matk条形码序列的第294-296位核苷酸为tgt、422位核苷酸为c、425位核苷酸为g时，待测药材为马齿苋；当叶绿体基因matk条形码序列的第294-296位核苷酸为cgg、第422位核苷酸为g、425位核苷酸为a时，待测药材为毛马齿苋。
4、其中，基于genbank登陆号为mt923439.1的细胞核基因its条形码序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
5、其中，基于genbank登陆号为mh037654.1的叶绿体基因matk条形码序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.3-4所示。
6、本专利技术所述的鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重pcr方法，包括如下步骤：提取待测样品的基因组dna作为模板，采用核苷酸序列如seq id no.1-2所示和/或核苷酸序列如seq id no.3-4所示的特异性引物对进行pcr扩增，当pcr产物电泳后出现150bp条带，则待测样品为马齿苋；若出现173bp条带，则待测样品为毛马齿苋，当pcr产物电泳后无条带出现，则待测样品为除毛马齿苋外的马齿苋伪品。
7、其中，所述待测样品为含有马齿苋和/或毛马齿苋或除毛马齿苋外的马齿苋伪品的药材。
8、其中，所述除毛马齿苋外的马齿苋伪品包括鸭跖草、鼠曲草、垂盆草、墨旱莲、佛甲草。
9、其中，所述pcr反应体系中的引物浓度均为0.10μm～0.20μm。
10、其中，所述pcr反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56～60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min。
11、其中，所述pcr聚合酶为rtaq dna聚合酶或rtaq hot start version dna聚合酶。
12、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本专利技术填补了目前关于马齿苋与伪品鉴定的空白，能够同时鉴别待测样品中的马齿苋、毛马齿苋，并排除了其他药材对本专利技术的干扰，方法简单可靠，不受药材性状的影响，可对药材粉末进行准确鉴定。
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1.一种DNA条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，所述DNA条形码为细胞核基因ITS条形码，其序列的GenBank登陆号为MT923439.1，当细胞核基因ITS条形码序列的第490-491位核苷酸为CC、第605位核苷酸为A时，待测药材为马齿苋；当细胞核基因ITS条形码序列的第490-491位核苷酸为TT、第605位核苷酸为T时，待测药材为毛马齿苋。
2.根据权利要求1所述的DNA条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，所述DNA条形码为叶绿体基因matK条形码，其序列的GenBank登陆号为MH037654.1，当叶绿体基因matK条形码序列的第294-296位核苷酸为TGT、422位核苷酸为C、425位核苷酸为G时，待测药材为马齿苋；当叶绿体基因matK条形码序列的第294-296位核苷酸为CGG、第422位核苷酸为G、425位核苷酸为A时，待测药材为毛马齿苋。
3.根据权利要求1所述的DNA条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，基于GenBank登陆号为MT923439.1的细胞核基
4.根据权利要求2所述的DNA条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，基于GenBank登陆号为MH037654.1的叶绿体基因matK条形码序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
5.一种鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对进行PCR扩增，当PCR产物电泳后出现150bp条带，则待测样品为马齿苋；若出现173bp条带，则待测样品为毛马齿苋，当PCR产物电泳后无条带出现，则待测样品为除毛马齿苋外的马齿苋伪品。
6.根据权利要求5所述的鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重PCR方法，其特征在于，所述待测样品为含有马齿苋和/或毛马齿苋或除毛马齿苋外的马齿苋伪品的药材。
7.根据权利要求5所述的鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重PCR方法，其特征在于，所述除毛马齿苋外的马齿苋伪品包括鸭跖草、鼠曲草、垂盆草、墨旱莲、佛甲草。
8.根据权利要求5所述的鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重PCR方法，其特征在于，所述PCR反应体系中的引物浓度均为0.10μM～0.20μM。
9.根据权利要求5所述的鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重PCR方法，其特征在于，所述PCR反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56～60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min。
10.根据权利要求5所述的鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋的多重PCR方法，其特征在于，所述PCR聚合酶为rTaq DNA聚合酶或rTaq Hot Start Version DNA聚合酶。
...【技术特征摘要】
1.一种dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，所述dna条形码为细胞核基因its条形码，其序列的genbank登陆号为mt923439.1，当细胞核基因its条形码序列的第490-491位核苷酸为cc、第605位核苷酸为a时，待测药材为马齿苋；当细胞核基因its条形码序列的第490-491位核苷酸为tt、第605位核苷酸为t时，待测药材为毛马齿苋。
2.根据权利要求1所述的dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，所述dna条形码为叶绿体基因matk条形码，其序列的genbank登陆号为mh037654.1，当叶绿体基因matk条形码序列的第294-296位核苷酸为tgt、422位核苷酸为c、425位核苷酸为g时，待测药材为马齿苋；当叶绿体基因matk条形码序列的第294-296位核苷酸为cgg、第422位核苷酸为g、425位核苷酸为a时，待测药材为毛马齿苋。
3.根据权利要求1所述的dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，基于genbank登陆号为mt923439.1的细胞核基因its条形码序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
4.根据权利要求2所述的dna条形码在鉴定/区分马齿苋和/或毛马齿苋中的应用，其特征在于，基于genbank登陆号为mh037654.1的叶绿体基因matk条形码序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.3-4所示。
5.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱润，周海琴，张静，胡剑虹，张开雪，陈盛君，李松，郭星宇，谢丰璞，海丰，张景，
申请(专利权)人：江阴天江药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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