本发明专利技术提供一种合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：将luz15、luz16、psmH和psmF基因与核糖体结合位点BBa_B0034插入所述合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的基因组和/或外源质粒中，并将所述luz15的核糖体结合位点序列更改为BBa_B0035；将所述psmH的核糖体结合位点序列更改为BBa_B0032；将所述psmF的核糖体结合位点序列更改为BBa_B0029；将所述luz16的核糖体结合位点序列更改为BBa_B0032。使用本发明专利技术所述构建方法制得的重组MG1655‑菌株的褪黑素产量可达308mg/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法，具体涉及一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法、一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655的菌株、一种含有褪黑素的大肠杆菌培养物及一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法的应用。
技术介绍
1、褪黑素是一种广泛存在于自然界的分子，多种生物能够合成它。其在细菌中的普遍分布尤其是在原始细菌（蓝细菌和α-变形菌）中表明这种分子可能是通过内共生过程演化而来，蓝藻和α-变形菌被早期原核生物吞噬后，最终分别进化为叶绿体和线粒体，因此所有单细胞和多细胞生物最终在这些细胞器中产生这种关键的吲哚胺，其功能在所有生物体的进化过程中一直保留下来，通常作为抗氧化剂，以保护细胞。在动物植物或者微生物体内，以色氨酸为前体，通过4步催化反应生成褪黑素。
2、公开了一种褪黑素的合成方法，由丙二酸二乙酯与丙烯腈为原料，经过加成、酯的氨解、偶合、重排、酰胺的水解、脱羧及酰化等步骤得到褪黑素。
3、公开了一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法。将新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在低气压环境中进行光照培养而获得褪黑素。
4、大肠杆菌k-12 mg1655菌株被认为是一种适合工业生产的宿主菌株，除了具有最佳的代谢网络外，其还具有较高的生长速度和强大的耐用性，常用于表达外源基因。所以使用代谢网络清晰的大肠杆菌生产褪黑素，对研究褪黑素高产关键节点，增加褪黑素产量，提高其工业价值具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
4、将luz15、luz16、psmh和psmf基因与核糖体结合位点bba_b0034插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的基因组和/或外源质粒中，并将所述luz15的核糖体结合位点序列更改为bba_b0035；将所述psmh的核糖体结合位点序列更改为bba_b0032；将所述psmf的核糖体结合位点序列更改为bba_b0029；将所述luz16的核糖体结合位点序列更改为bba_b0032；
5、所述luz15基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述psmh基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述psmf基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述luz16基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述bba_b0034的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述bba_b0035序列的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述bba_b0029的核苷酸序列序列如seq idno.7所示；所述bba_b0032的核苷酸序列序列如seq id no.8所示。
6、本专利技术创造性地将上述luz15、luz16、psmh和psmf4种基因导入大肠杆菌mg1655菌株中，并使用不同表达强度的核糖体结合位点序列替换每个基因原有的核糖体结合位点序列，达到调节基因不同表达强度的目的，最终经过平衡外源基因表达强度， 20ml发酵约50h可以得到约308mg/l褪黑素。且该制备方法操作简单，产量高，易于工业生产。
7、其中luz15为actinomadura luzonensis来源的基因tryptophan 2,3-dioxygenase；其中luz16为actinomadura luzonensis来源的基因o-methyltransferase；其中psmh为streptomyces griseofuscus来源的基因plp-dependent decarboxylase ；其中psmh为streptomyces griseofuscus来源的基因n-acetyltransferase 。
8、所述将luz15、luz16、psmh和psmf基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的基因组，插入位置为大肠杆菌mg1655的假基因位点处。
9、所述将luz15、luz16、psmh和psmf基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的基因组和/或外源质粒中，其中将luz15、luz16、psmh和psmf基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的外源质粒中，所述外源质粒为pet28a(+)。
10、第二方面，本专利技术提供一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655的菌株，所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655的菌株由权利要求1所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法制得。
11、第三方面，本专利技术提供一种含有褪黑素的大肠杆菌培养物，所述培养物采用如下制备方法进行制备，所述制备方法包括：
12、将第一方面中所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655的菌株接种于培养基中，在32-40℃、120-200 rpm的条件下培养30-50 h即得。
13、第四方面，本专利技术提供如第三方面所述的含有褪黑素的大肠杆菌培养物，所述培养基中含有na2hpo4、 kh2po4、 nacl、 nh4cl、 酵母提取物、葡萄糖，、柠檬酸、色氨酸、mgso4 .7h2o、 cacl2、 feso4•7h2o、 cucl2•2h2o、 cocl2•6h2o、 mncl2•4h2o、zncl2、na2moo4•2h2o和水。
14、第四方面，本专利技术提供如第一方面所述的合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法，所述构建方法在制备含褪黑素药品中的应用。
15、相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
16、1.本专利技术创造性地将上述luz15、luz16、psmh和psmf4种基因导入大肠杆菌mg1655菌株中，并使用不同表达强度的核糖体结合位点序列替换每个基因原有的核糖体结合位点序列，达到调节基因不同表达强度的目的，最终经过平衡外源基因表达强度， 20ml发酵约50h可以得到约308mg/l褪黑素。且该制备方法操作简单，易于工业生产。
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【技术保护点】
1.一种合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的构建方法，其特征在于，所述将luz15、luz16、psmH和psmF基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的基因组，插入位置为大肠杆菌MG1655的假基因位点处。
3.如权利要求1所述的合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的构建方法，其特征在于，所述将luz15、luz16、psmH和psmF基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的基因组和/或外源质粒中，其中将luz15、luz16、psmH和psmF基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的外源质粒中，所述外源质粒为pet28a(+)。
4.一种合成褪黑素大肠杆菌MG1655的菌株，其特征在于，所述合成褪黑素大肠杆菌MG1655的菌株由权利要求1所述合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的构建方法制得。
5.一种含有褪黑素的大肠杆菌培养物，其特征在于，所述培养物采用如下制备方法进行制备，所述制备方法包括：
6.如权利要求4所述的含有褪黑素的大肠杆菌培养物，其特征在于，所述培养基中含有Na2HPO4、 KH2PO4、 NaCl、 NH4Cl、 酵母提取物、葡萄糖、柠檬酸、色氨酸、MgSO4 .7H2O、CaCl2、 FeSO4•7H2O、 CuCl2•2H2O、 CoCl2•6H2O、 MnCl2•4H2O、ZnCl2、Na2MoO4•2H2O和水。
7.如权利要求1所述的合成褪黑素大肠杆菌MG1655菌株的构建方法在制备含褪黑素药品中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法，其特征在于，所述将luz15、luz16、psmh和psmf基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的基因组，插入位置为大肠杆菌mg1655的假基因位点处。
3.如权利要求1所述的合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的构建方法，其特征在于，所述将luz15、luz16、psmh和psmf基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的基因组和/或外源质粒中，其中将luz15、luz16、psmh和psmf基因插入所述合成褪黑素大肠杆菌mg1655菌株的外源质粒中，所述外源质粒为pet28a(+)。
4.一种合成褪黑素大肠杆菌m...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩，窦广进，熊博，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
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