【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物，尤其涉及一种基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法及其应用。
技术介绍
1、肠道菌群是寄居在人体肠道内的微生物群，人体肠道内寄生的细菌数目40万亿个，基因总数约为人自身基因数目的150倍。由此可以看出，肠道菌群是一个非常庞大的群体，肠道菌群也被称作人体的“第二基因组”、“第二大脑”或“肠脑”。肠道菌群在正常情况下可以和宿主及外部环境建立起动态的生态平衡，一旦肠道菌群紊乱平衡失衡，会引发宿主屏障功能丧失、炎症和免疫功能丧失等，从而诱发宿主疾病。
2、二代益生菌(next-generation probiotics，npgs)是一种可以干预人类疾病的肠道微生物群，指目前还未被确定，但是当给与足够剂量时，能通过特定作用对动物肌体健康、生产特性等产生影响，适用于预防和治疗机体代谢障碍或改善宿主健康的活体微生物。npgs将以肠道共生菌作为主体，通过人工设计制成微生态制剂，作用于宿主重塑肠道微生物，以发挥其特定功能。目前已知的二代益生菌包括：嗜粘蛋白阿克曼氏菌、脆弱拟杆菌等。
3、嗜粘蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila，简称akk菌)是一种常见的人类肠道共生菌，可以依靠肠粘液层的粘蛋白生存，主要定植在胃肠道的外黏液层，以胃肠道的粘蛋白作为自身生长的碳和氮来源，其消耗粘蛋白与杯状细胞再生粘蛋白能够达到动态平衡，从而维持黏液层稳定。在过去十年中，越来越多的研究证明，糖尿病、心血管疾病、疾病性肠病和神经疾病的患者胃肠道akk菌丰度较低，这也表明akk菌将成为下一代有临床
4、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)是定殖于哺乳动物肠道内的共生菌，对于维持宿主正常机能必不可少，且其分泌的psa的益生作用已成为共识，因此脆弱拟杆菌作为潜在益生菌株具有良好的开发前景。多项研究进一步揭示，脆弱拟杆菌与炎症性肠炎以及免疫性疾病密切相关。同时与胃肠道中的其他厌氧菌相比，脆弱拟杆菌表现出最高的抗生素耐药性和最多的抗生素耐药机制。这不仅使得治疗脆弱拟杆菌引起的感染变得困难，而且有可能成为抗生素抗性基因的储存库，导致它们通过整合转座子、整合遗传元件转移到其他正常细菌菌群中。
5、2022年中国食品科学技术学会发布了《t/cifst 009-2022食品用益生菌通则》，对作为食品原料使用的益生菌的基本要求、菌株水平要求、生产过程要求、技术要求、贮存和运输、在食品中的应用及标签标识做出了基本规定，同时要求益生菌活菌数≥1.0×108cfu/g(ml)，其中cfu为菌落形成单位，指在细菌培养中，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。
6、目前二代益生菌检测方法稀缺，传统培养计数中，有些受损细胞代谢活力不足，以至于无法被计数到，准确率有待提高，且部分二代益生菌对培养环境要求较高，检测结果具有滞后性。
7、综上所述，如何开发一种针对二代益生菌的高效准确检测方法，并将其应用于实时监测二代益生菌的加工生产过程，已成为目前本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法及其应用。本专利技术通过将二代益生菌进行预处理和染色，上机1分钟后即可获得活菌数数据和细胞状态比例，实时提供活菌定量检测数据和质量评估供生产过程进行快速分析。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，所述二代益生菌包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌和/或脆弱拟杆菌。
4、优选地，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法包括：对二代益生菌进行预处理并染色，获得待测样品，将待测样品放入流式细胞仪检测，获得检测结果，对检测结果进行数据分析。
5、优选地，所述预处理包括：将二代益生菌与稀释液混合，获得稀释后的二代益生菌。
6、优选地，所述稀释液包括蛋白胨和无机盐。
7、本专利技术所提供的稀释液可以用于调节待测样品的浓度，并对细菌起到保护作用，适用于流式细胞仪检测二代益生菌，尤其适用于检测二代益生菌中的厌氧菌和/或兼性厌氧菌。
8、优选地，所述蛋白胨包括酪蛋白胨、酵母蛋白胨或大豆蛋白胨中的任意一种或至少两种的组合。
9、优选地，所述无机盐包括氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合。
10、优选地，所述稀释液中蛋白胨的浓度为0.8-1.2g/l(例如0.8g/l、0.9g/l、1.0g/l、1.1g/l或1.2g/l等)，无机盐的浓度为7-10g/l(例如7g/l、8g/l、8.5g/l、9g/l或10g/l等)。
11、优选地，所述稀释液包括1.0g/l酪蛋白胨和8.5g/l氯化钠。
12、优选地，所述染色包括：将颗粒数为2×103-2×104/μl(例如2×103/μl、4×103/μl、6×103/μl、8×103/μl、1×104/μl、1.2×104/μl、1.4×104/μl、1.6×104/μl、1.8×104/μl或2×104/μl等)的稀释后的二代益生菌与染色剂混合，涡旋混匀后避光孵育10-20min(例如10min、13min、15min、17min或20min等)。
13、优选地，所述染色剂包括syto 9、syto 11、syto 16或碘化丙啶中的任意一种或至少两种的组合。
14、优选地，所述染色剂中syto 9与碘化丙啶的浓度比为1：(0.8-1.2)(例如1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1或1:1.2等)。
15、优选地，所述染色剂与稀释后的二代益生菌的体积比为1：(800-1200)(例如1:800、1:900、1:1000、1:1100或1:1200等)。
16、染色剂的用量过多或过少会导致平行样之间差异较大，优选为染色剂与稀释后的二代益生菌的体积比为1:1000。
17、优选地，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法还包括制作上机数据分析模版的步骤。
18、优选地，所述上机数据分析模版包括活细胞信号模板和死细胞信号模板。
19、优选地，所述活细胞信号模版的制作方法包括：将二代益生菌活化处理后立即使用syto 9单染上机，调节b525-a通道电压后，至荧光信号集中在x轴fsc、y轴ssc流式图中央或靠近中央区域，获得第一电压参数和第一图像线性系数。
20、优选地，所述死细胞信号模版的制作方法包括：将经异丙醇处理破坏细胞膜的二代益生菌使用syto 9和碘化丙啶混染上机，调节b585-a通道电压后，至荧光信号集中在x轴fsc、y轴ssc流式图中央或靠近中央区域，获得第二电压参数和第二图像线性系数。
21、优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述二代益生菌包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌和/或脆弱拟杆菌。
2.根据权利要求1所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法包括：对二代益生菌进行预处理并染色，获得待测样品，将待测样品放入流式细胞仪检测，获得检测结果，对检测结果进行数据分析。
3.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述预处理包括：将二代益生菌与稀释液混合，获得稀释后的二代益生菌；
4.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述染色包括：将颗粒数为2×103-2×104/μL的稀释后的二代益生菌与染色剂混合，涡旋混匀后避光孵育10-20min；
5.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法还包括制作上机数据分析模版的步骤；
6.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时
7.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述数据分析包括：调节B525-A、B585-A通道补偿使对应阴阳群分开，抠除空白荧光背景后，分别与活细胞信号模板和死细胞信号模板进行比对，确定活死细胞集群位置后进行圈门，根据设备显示的颗粒数计算活菌数AFU＝N×a×1000，其中N为仪器测定活菌浓度结果，颗粒数/μL，a为样品稀释倍数。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法包括以下步骤：
9.一种二代益生菌的实时定量检测装置，其特征在于，所述实时定量检测装置用于执行权利要求1-8任一项所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法中的步骤；
10.如权利要求1-8任一项所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法和/或权利要求9所述的二代益生菌的实时定量检测装置在二代益生菌产品开发和/或二代益生菌生产工艺开发中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述二代益生菌包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌和/或脆弱拟杆菌。
2.根据权利要求1所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法包括：对二代益生菌进行预处理并染色，获得待测样品，将待测样品放入流式细胞仪检测，获得检测结果，对检测结果进行数据分析。
3.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述预处理包括：将二代益生菌与稀释液混合，获得稀释后的二代益生菌；
4.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述染色包括：将颗粒数为2×103-2×104/μl的稀释后的二代益生菌与染色剂混合，涡旋混匀后避光孵育10-20min；
5.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法还包括制作上机数据分析模版的步骤；
6.根据权利要求2所述的基于流式细胞术的二代益生菌实时定量检测方法，其特征在于，所述将待测样品放入流式细胞仪检测包括：以流式细胞仪配置的488nm氩离子激光器激发，选取低速进行样...
【专利技术属性】
技术研发人员：方曙光，闫启芳，蒋大成，周荷雨，陈晔敏，
申请(专利权)人：微康益生菌苏州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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