【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药材质量控制，具体涉及一种用于中药材中赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器的制备方法与应用。
技术介绍
1、中药材作为防治疾病的主要武器，对保障人民健康发挥重要作用。然而，中药材在种植、采收、运输和贮藏过程中，容易因方法不当而引起大量真菌生长和毒素的积累，这会直接影响中药材的质量与疗效。赭曲霉毒素a(ota)是由青霉属和青霉属菌株产生的一种有毒次级代谢物，具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、细胞毒性等，是污染中药材的常见真菌毒素。2020版的中华人民共和国药典也进一步增订了中药材中ota的质量控制相关规定以提升中药材的安全性。
2、目前，用于ota检测的一般方法包括高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)和免疫分析，然而hplc-ms的设备昂贵，预处理费时，免疫测定可能会受到抗体交叉反应和保质期短的限制，因此，开发一种操作简单、成本低且准确灵敏的方法用于ota的检测具有重要意义。
3、核酸适配体是一类能与目标分子高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列，已作为新兴的分子识别元件广泛应用于电化学传感器的构建。目前，基于核酸适配体检测ota的电化学传感策略主要包括链置换策略、适配体信标策略和酶辅助识别策略。然而，传统的链置换策略需要优化与适配体互补的dna序列，不稳定的靶标/适配体复合物会导致高背景，过度稳定的复合物会减慢靶标与适配体的结合反应，导致传感器灵敏度受限。此外，溶液中游离的适配体、非目标依赖的弱转换事件、异质界面的空间位阻均可能会干扰适配体与靶标的结合，从而影响复杂基质中目标检测的特异性与准
4、因此，本专利技术提出一种用于中药材中赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器的制备方法及应用，具体是通过在均相介质中，ota诱导适配体转变为稳定反向平行的g-四链体抵抗核酸外切酶i(exo i)的切割，负载有捕获探针的链霉亲和素偶联的磁珠高效捕获被ota保护的适配体，结合基于地高辛标记和末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)催化的信号放大策略，构建可用于中药材赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器，该传感器具有成本低、准确度好、灵敏度高等优点，在中药材外源污染物控制方面具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于中药材中赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器的制备方法，为中药材外源污染物的控制提供新策略。
2、本专利技术的目的在于提供一种检测中药材中赭曲霉毒素a的新方法，为中药材外源污染物的控制提供新方法。
3、本专利技术的技术方案概括如下：
4、本专利技术提供一种用于中药材中赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器的制备方法，依序包括如下步骤：
5、(1)设计探针，所述探针包括能够靶向识别赭曲霉毒素a的适配体和捕获探针，适配体序列为seq.id.no.1，记为apt；捕获探针序列为seq.id.no.2，记为cp；
6、所述的适配体序列seq.id.no.1为
7、5’-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’；
8、所述的捕获探针序列seq.id.no.2为
9、5’-gatgctccctttacgccacccacacccgatcttt-biotin-3’；
10、(2)均相识别，采用步骤(1)所述的apt与含有赭曲霉毒素a的样品反应，通过exo i酶切反应，高温变性，冷却至室温，获得被赭曲霉毒素a保护的apt溶液；所述的样品为经过预处理的中药材川贝母溶液；所述的预处理的中药材川贝母溶液由下述步骤制得：将川贝母研磨成粉，过4号筛获得样品粉末，称取样品粉末1g置于15ml离心管中，加入0.2g nacl和5ml由体积比为80:20的无水甲醇与水配制的甲醇溶液，涡旋混匀后超声15min，于6000rpm/min下离心5min，用由体积比为20:80的无水甲醇与pbs配制成的甲醇-pbs溶液稀释20倍，过0.22μm滤膜，获得样品，放置4℃备用；所述的含有赭曲霉毒素a的样品采用标准加入法制备得到(为常规的加标方法)。
11、(3)磁珠捕获，首先，将步骤(1)所述的捕获探针序列cp固定于链霉亲和素偶联的磁珠mmbs表面，获得cp-mmbs；接着，将步骤(2)所述的被赭曲霉毒素a保护的apt溶液加入含有cp-mmbs的试管中，旋转，孵育，清洗，获得apt/cp-mmbs；
12、(4)tdt延伸反应，配制50μl tdt延伸反应体系并将其加入含有步骤(3)所述apt/cp-mmbs的试管中，室温下反应延伸30min，旋转，孵育，清洗，获得tdt-apt/cp-mmbs；其中，所述的50μl tdt延伸反应体系成分为0.1μl的dig-11-dutp，0.3μl的datp，0.2μl的tdt，5μl的缓冲液，44.4μl的双蒸水。
13、(5)hrp结合反应，将anti-dig-hrp溶液加入步骤(4)获得的tdt-apt/cp-mmbs，室温旋转孵育15min，清洗获得hrp/tdt-apt/cp-mmbs，用10μl pbs重悬hrp/tdt-apt/cp-mmbs，得到重悬液；
14、(6)对磁式玻碳电极mgce进行预处理，然后依次在无水乙醇和超纯水中各超声1min以除去残留的al2o3粉末及其他杂质；接着，将步骤(5)所得的重悬液滴加到预处理后的磁式玻碳电极表面，形成用于中药材中赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器。
15、具体地，所述的样品为经过预处理的中药材川贝母溶液。
16、进一步地，所述的预处理包括如下步骤：将川贝母研磨成粉，过4号筛获得样品粉末，称取样品粉末1g置于15ml离心管中，加入0.2g nacl和5ml甲醇-水溶液，涡旋混匀后超声15min，于6 000rpm/min下离心5min，用甲醇-pbs溶液稀释20倍，过0.22μm滤膜，放置4℃备用。
17、本专利技术提供一种检测中药材中赭曲霉毒素a的方法，所述方法包括如下步骤：
18、(1)设计探针，所述探针包括能够靶向识别赭曲霉毒素a的适配体和捕获探针，所述适配体序列为seq.id.no.1，记为apt；所述捕获探针序列为seq.id.no.2，记为cp；
19、所述的适配体序列seq.id.no.1为
20、5’-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’，
21、所述的捕获探针序列seq.id.no.2为
22、5’-gatgctccctttacgccacccacacccgatcttt-biotin-3’；
23、(2)均相识别：采用步骤(1)所述的apt与含有赭曲霉毒素a的样品反应，通过exo i酶切反应，高温变性，冷却至室温，获得被赭曲霉毒素a保护的apt溶液；
24、(3)磁珠捕获：首先，将步骤(1)所述的捕获探针序列cp固定于链霉亲和素偶联的磁珠mmbs表面本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于中药材中赭曲霉毒素A检测的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述样品为经过预处理的中药材川贝母溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的预处理的中药材川贝母溶液由下述步骤制得的：将川贝母研磨成粉，过4号筛获得样品粉末，称取样品粉末1 g置于15 mL离心管中，加入0.2 g NaCl和5 mL甲醇-水溶液，涡旋混匀后超声15 min，于6000 rpm/min下离心5 min，用甲醇-PBS溶液稀释20倍，过0.22 μm滤膜，放置4 ℃备用。
4.一种检测中药材中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种用于中药材中赭曲霉毒素a检测的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述样品为经过预处理的中药材川贝母溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的预处理的中药材川贝母溶液由下述步骤制得的：将川贝母研磨成粉，过4号...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁秀华，许雄伟，陈锦元，危青霞，杨良永，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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