【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及再生医学，特别是涉及到一种用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法。
技术介绍
1、关节软骨是一种结缔组织，可以起到支撑、润滑、吸收缓冲力等作用。软骨缺损患者的人数随着社会老龄化显著增加。修复软骨受损最理想的方案是使软骨再生，这能最大程度上使原有软骨组织恢复功能，水凝胶因其组织样特性，是目前研究的热点。同时，3d打印技术的发展为制备具有特定孔隙形状、更有利于软骨组织修复的支架提供了可能。
2、因软骨组织的复杂结构，想要实现效果良好的软骨再生，要考虑的问题有很多。目前，针对大多数软骨修复方法，主要针对材料进行研究，以获得良好的成软骨性能。软骨修复支架通常具备以下性质：(1)支架材料的生物相容良好，在植入组织的缺损部位后不引起炎症反应和免疫反应；体内可降解，发挥作用后被机体自然降解；一定的力学和润滑性能，可以提供适宜软骨再生的微环境，并阻止关节炎的发生和发展；有利于细胞的黏附、生长、增殖和分化；(2)良好的力学性能，能够抵抗施加的拉伸和压缩力量，防止产生破坏；(3)一定的孔隙率和联通的内部孔隙，有利于营养物质、细胞代谢废物的运输，以及新生组织的长入。人天然软骨的渗透率在0.1~10.0×10-9m2。支架内部孔径的尺寸要超过100微米才有利于为细胞提供必要的氧气及营养物质，新组织的形成则需要更大的孔径尺寸；(4)支架形状应能被加工为各种形状，便于与缺损部位相匹配。
3、现有的大多数对软骨修复水凝胶支架的研究部分满足了上述要求，如考虑到水凝胶的生物相容性、力学性能和可变的形状，但忽略了现有的大多
4、综上所述，在满足软骨修复支架宏观层面要求的条件下，研究出一种通过软骨修复支架的结构设计，形成有利于细胞生长的微环境，控制对细胞的物理刺激，实现对骨髓间充质干细胞的定向分化从而获得成软骨性能更加良好的新型软骨修复支架具有重要的研究意义及临床应用意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种实现定向软骨组织分化，增强软骨修复性能的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法。
2、本专利技术的目的可通过如下技术措施来实现：用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，该用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法包括：
3、步骤1，构建多孔单细胞结构；
4、步骤2，选取单胞组成支架模型，采用cfd方法进行模拟分析，得到有利于软骨细胞和软骨组织分化的支架结构；
5、步骤3，进行细胞分化筛选；
6、步骤4，进行光固化3d打印，制备软骨组织再生修复的水凝胶支架。
7、本专利技术的目的还可通过如下技术措施来实现：
8、在步骤1，以1600微米正方体晶胞为基础，对正方体晶胞进行切除，形成多孔结构，通过在其内部添加支撑圆柱，以满足成软骨需要和力学性能要求。
9、在步骤1，构建的多孔单细胞结构包括三种，结构一为中空单胞结构，其开孔边长为1000微米；结构二为对角支撑单胞结构，其内部支撑圆柱的直径为400um；结构三为减少两条对角支撑柱，增加一条横向支撑柱的改性对角支撑单胞结构，内部支撑圆柱的直径也为400um。
10、在步骤2，选取单胞组成5×5×5的支架模型，采用cfd方法进行模拟分析，以支架表面流体剪应力和支架的渗透性为判断结果，选取合适软骨细胞和软骨组织分化的结构。
11、在步骤2，采用步骤1中的3种单胞结构，构建出5种不同的支架模型，并对其进行cfd仿真分析，5种不同的支架模型包括：均质支架a-c为三种单胞模型独自构成的支架；复合支架a中，对角支撑胞元构成支架的外层，中空胞元构成支架的内部；复合支架b中，改性对角胞元构成支架的外层，中空胞元构成支架的内部。
12、在步骤3，通过cck-8法评估细胞在凝胶材料体系内的活力，使用的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞，按最佳细胞接种数将细胞进行接种培养，待培养时间结束，检测细胞活力，计算相对细胞存活率。
13、步骤4包括：
14、步骤4a、使用solidworks建立支架模型，根据软骨缺损部位的形状，通过ct扫描建立缺损模型；
15、步骤4b、将软骨支架模型格式转换为stl格式用于3d打印；
16、步骤4c、将stl格式的模型文件导入3d打印机；
17、步骤4d、进行3d打印墨水的制备；
18、步骤4e、使用光交联逐层固化方法制备3d打印模型。
19、步骤4d包括：
20、(d1)、将gelma、pegda、光引发剂lap和水按照5wt%、10wt%、0.5wt%质量比例混合，制备出打印墨水；
21、(d2)、将墨水进行过滤，用于清除颗粒、液体和气体的除菌过滤；
22、(d3)、将打印墨水装入消毒过的料筒，准备进行3d打印。
23、步骤d1，制备gelma时，在磁力搅拌器中，使用10ml的pbs溶液溶解1g明胶，50°c条件下充分溶解，向其中添加0.8ml甲基丙烯酸酐，随后在避光、50°c的水浴条件下反应3小时；向其中加入40ml的pbs稀释溶液并继续搅拌10分钟；之后将反应后的溶液使用透析袋于去离子水中透析5天以上，直到溶液无特殊气味，期间使用磁力搅拌器加速透析速率，并每天换液；透析完成后将溶液置于冻干机中冻干，得到gelma；gelma由明胶与甲基丙烯酸酐的反应改性生成，其中明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为10:8；
24、按比例取gelma、pegda、lap、磷酸缓冲液避光条件下进行混合，充分溶解后可得到光固化3d打印的软骨修复水凝胶墨水。
25、该用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法还包括，在步骤4之后，进行压缩力学试验，在单轴压缩载荷下进行测试，记录位移和力等数值，固定用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的下表面，取压缩过程中用于软骨组织再生修复的水凝胶支架出现压溃时所承受应力的最大值，测试支架的力学性能。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，该用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤1，以1600微米正方体晶胞为基础，对正方体晶胞进行切除，形成多孔结构，通过在其内部添加支撑圆柱，以满足成软骨需要和力学性能要求。
3.根据权利要求2所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤1，构建的多孔单细胞结构包括三种，结构一为中空单胞结构，其开孔边长为1000微米；结构二为对角支撑单胞结构，其内部支撑圆柱的直径为400um；结构三为减少两条对角支撑柱，增加一条横向支撑柱的改性对角支撑单胞结构，内部支撑圆柱的直径也为400um。
4.根据权利要求3所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤2，选取单胞组成5×5×5的支架模型，采用CFD方法进行模拟分析，以支架表面流体剪应力和支架的渗透性为判断结果，选取合适软骨细胞和软骨组织分化的结构。
5.根据权利要求4所述的用于软骨组织再生修复
6.根据权利要求1所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤3，通过CCK-8法评估细胞在凝胶材料体系内的活力，使用的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞，按最佳细胞接种数将细胞进行接种培养，待培养时间结束，检测细胞活力，计算相对细胞存活率。
7.根据权利要求1所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，步骤4包括：
8.根据权利要求7所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，步骤4d包括：
9.根据权利要求8所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤d1，制备GelMA时，在磁力搅拌器中，使用10ml的PBS溶液溶解1g明胶，50°C条件下充分溶解，向其中添加0.8ml甲基丙烯酸酐，随后在避光、50°C的水浴条件下反应3小时；向其中加入40mL的PBS稀释溶液并继续搅拌10分钟；之后将反应后的溶液使用透析袋于去离子水中透析5天以上，直到溶液无特殊气味，期间使用磁力搅拌器加速透析速率，并每天换液；透析完成后将溶液置于冻干机中冻干，得到GelMA；GelMA由明胶与甲基丙烯酸酐的反应改性生成，其中明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为10:8；按比例取GelMA、PEGDA、LAP、磷酸缓冲液避光条件下进行混合，充分溶解后可得到光固化3D打印的软骨修复水凝胶墨水。
10.根据权利要求9所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，该用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法还包括，在步骤4之后，进行压缩力学试验，在单轴压缩载荷下进行测试，记录位移和力等数值，固定用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的下表面，取压缩过程中用于软骨组织再生修复的水凝胶支架出现压溃时所承受应力的最大值，测试支架的力学性能。
...【技术特征摘要】
1.用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，该用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤1，以1600微米正方体晶胞为基础，对正方体晶胞进行切除，形成多孔结构，通过在其内部添加支撑圆柱，以满足成软骨需要和力学性能要求。
3.根据权利要求2所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤1，构建的多孔单细胞结构包括三种，结构一为中空单胞结构，其开孔边长为1000微米；结构二为对角支撑单胞结构，其内部支撑圆柱的直径为400um；结构三为减少两条对角支撑柱，增加一条横向支撑柱的改性对角支撑单胞结构，内部支撑圆柱的直径也为400um。
4.根据权利要求3所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤2，选取单胞组成5×5×5的支架模型，采用cfd方法进行模拟分析，以支架表面流体剪应力和支架的渗透性为判断结果，选取合适软骨细胞和软骨组织分化的结构。
5.根据权利要求4所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤2，采用步骤1中的3种单胞结构，构建出5种不同的支架模型，并对其进行cfd仿真分析，5种不同的支架模型包括：均质支架a-c为三种单胞模型独自构成的支架；复合支架a中，对角支撑胞元构成支架的外层，中空胞元构成支架的内部；复合支架b中，改性对角胞元构成支架的外层，中空胞元构成支架的内部。
6.根据权利要求1所述的用于软骨组织再生修复的水凝胶支架的制备方法，其特征在于，在步骤3，通过cck-8法评...
【专利技术属性】
技术研发人员：史岩彬，王文广，林贵梅，甄承栋，李学林，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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