本发明专利技术涉及一种基于拟微小RNA与小激活RNA的核酸药物制备方法，涉及医药技术领域，所述核酸药物制备方法包括：根据靶标疾病的病理机制，选择致病基因和抗病基因；根据所述致病基因的mRNA序列，设计拟微小RNA单链寡核苷酸片段；根据所述抗病基因的mRNA序列，设计小激活RNA片段；将所述拟微小RNA单链寡核苷酸片段和所述小激活RNA片段进行杂合，得到核酸药物。本发明专利技术属于“一药多靶”的多靶点技术，摆脱了拟微小RNA技术和小激活RNA技术的局限性，扩展了应用性，最重要的是增强了药物治疗效果，减少了潜在的毒副作用。
1、拟微小rna技术，此技术是于17年前由本专利专利技术者为主专利技术并专利保护了的一种通过调控基因表达来改变细胞功能及疾病过程的人工设计的微小rna技术(专利申请号：200710072003.6，cn101054580a)。虽然仍然在被使用，但其属于“单靶点”基因干扰技术，这与小干扰rna(sirna)类似。应用拟微小rna技术原理设计的核酸分子因其“单靶点”性质以及频繁的脱靶作用而令其应用范围有限，且效果难以达到最佳。
2、小激活rna技术，是一类具有与微小rna的基因抑制功能相反的小rna，这类小rna是人为设计的双链寡核苷酸片段，能够识别且结合于靶基因dna的启动子序列区域，并激活该基因的转录过程从而提升靶基因表达和功能，故被称为“小激活rna(sarna)。类似于微小rna(mirna)，sarna属于“单靶点”基因干扰技术，每一个sarna只能够激活相应的某一个基因，因此具由与mirna同样的应用局限性。
>3、根据靶标疾病的病理机制，选择致病基因和抗病基因；4、根据所述致病基因的mrna序列，设计拟微小rna单链寡核苷酸片段；
5、根据所述抗病基因的mrna序列，设计小激活rna片段；
6、将所述拟微小rna单链寡核苷酸片段和所述小激活rna片段进行杂合，得到核酸药物。
7、进一步地，所述拟微小rna单链寡核苷酸片段为一段21-nt长度的拟微小rna单链寡核苷酸片段，以实现特异性地结合于所述致病基因的3′-端非翻译区域，从而抑制其表达和功能。
8、进一步地，根据所述抗病基因的mrna序列，设计小激活rna片段的步骤包括以下过程：
9、从基因组数据库检索所有灵长类动物的选定的抗病靶基因启动子序列，并对照包括dbtss数据库和ucsc基因组浏览器以最终确定转录起始位点；
10、根据选定的抗病靶基因启动子区域序列特征，翻译起始码tss上游200～2000bp区段内，应用自动搜索程序扫描启动子，寻找适合于设计sarna的基元；
11、根据选定sarna的基元设计一段21-nt长度的单链反义寡核苷酸片段，其中的5′-端2-8nt是sarna的种子序列，必须与靶基因启动子区域序列完全互补，而其余的序列只需部分互补即可；其中，片段必须符合以下条件：
12、(a)gc含量中等(40-65％)；(b)意义链的3′-端的稳定性应低于其5′-端的稳定性；(c)sarna能够识别并结合于该靶基因的启动子区域中的特异性基元，并避免非特异性的与其它非靶序列的结合，从而激活该基因的转录过程，起到增加基因表达水平和功能强度的作用；(d)避免在靶基因启动子富含cpg岛序列的区域设计sarna。
13、进一步地，应用自动搜索程序，通过使用美国国家生物技术信息中心的序列同源性比对搜索工具，对所设计的sarna反义链进行分析，以预测其与靶基因启动子特异性结合的概率；若发现可能存在或发生非特异性结合，须重新设计sarna序列。
14、第二方面，本专利技术提供了一种治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物，所述治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物是采用第一方面任一项所述的核酸药物制备方法制得；其中，所述致病基因包括meox1，所述抗病基因包括atp2a2。
15、进一步地，所述治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物为如seq id no.1所示的第一序列和如seq id no.2所示的第二序列的杂合体。
16、第三方面，本专利技术提供了一种治疗癌症的核酸药物，所述治疗癌症的核酸药物是采用第一方面任一项所述的核酸药物制备方法制得；其中，所述致病基因为致癌基因，所述抗病基因为抑制抗癌基因。
17、进一步地，所述致癌基因包括kras；所述抑制抗癌基因包括tp53。
18、进一步地，所述癌症包括结肠癌、肺癌。
19、进一步地，所述治疗癌症的核酸药物为如seq id no.3所示的第一序列和如seqid no.4所示的第二序列的杂合体。
20、本专利技术提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：
21、本专利技术提供了一种基于拟微小rna与小激活rna的核酸药物制备方法，本专利技术首次将拟微小rna技术和小激活rna技术进行有机结合，得到一种用于设计小核酸治疗药物的拟微小rna与小激活rna杂合体技术。本专利技术不仅仅是拟微小rna技术和小激活rna技术的简单升级版，而且是融合了两者各自的优势，赋予了单一药物同时具备消除致病基因功能和保护抗病基因功能的作用和更加有效治疗疾病的效果，属于“一药多靶”的多靶点技术，摆脱了拟微小rna技术和小激活rna技术的局限性，扩展了应用性，最重要的是增强了药物治疗效果，减少了潜在的毒副作用，为制备核酸药物提供了一种新的设计思路。具体来说，本专利技术至少具有如下特点：
22、(1)将拟mirna对靶基因的抑制作用与sarna对靶基因的激活作用合二为一，具备“一药多靶”的多靶点药理学特性和作用原理，使之成为一个新型的技术。关键是，这种“一箭双雕”的杂合体药物显著优于它们各自单独的作用以及两者联合用药的药效。
23、(2)应用此专利技术所设计的单一个小核酸药物，既能够降低致病基因的表达和功能，也能够激发提升抗病基因的表达和功能。至今未见任何其它能够同时起到“双簧”作用的核酸技术。
24、(3)微小rna与小激活rna杂合体技术并非一个单一药物，而是一种策略和技术，运用此技术的原理、方法和步骤，理论上可以设计并制备无数的针对各种不同疾病的杂合体小核酸药物，并研发成为临床用药，具有极大的应用潜力。
25、(4)为了验证本专利技术拟微小rna与小激活rna杂合体技术潜在的普遍应用性和可行性，已经实验验证的两个mir-m x sarna杂合体序列的可行性、可用性和可靠性。这两个寡核苷酸片段本身就具有发展成为临床应用的小核酸药物的潜力。
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【技术保护点】
1.一种基于拟微小RNA与小激活RNA的核酸药物制备方法，其特征在于，所述核酸药物制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于拟微小RNA与小激活RNA的核酸药物制备方法，其特征在于，所述拟微小RNA单链寡核苷酸片段为一段21-nt长度的拟微小RNA单链寡核苷酸片段，以实现特异性地结合于所述致病基因的3′-端非翻译区域，从而抑制其表达和功能。
3.根据权利要求1所述的基于拟微小RNA与小激活RNA的核酸药物制备方法，其特征在于，根据所述抗病基因的mRNA序列，设计小激活RNA片段的步骤包括以下过程：
4.根据权利要求3所述的基于拟微小RNA与小激活RNA的核酸药物制备方法，其特征在于，应用自动搜索程序，通过使用美国国家生物技术信息中心的序列同源性比对搜索工具，对所设计的saRNA反义链进行分析，以预测其与靶基因启动子特异性结合的概率；若发现可能存在或发生非特异性结合，须重新设计saRNA序列。
5.一种治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物，其特征在于，所述治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物是采用权利要求1～4任一项所述的核酸药物制备方法制得；其中，所述致病基因包括Meox1，所述抗病基因包括ATP2A2。
6.根据权利要求5所述的治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物，其特征在于，所述治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物为如SEQ ID NO.1所示的第一序列和如SEQ IDNO.2所示的第二序列的杂合体。
7.一种治疗癌症的核酸药物，其特征在于，所述治疗癌症的核酸药物是采用权利要求1～4任一项所述的核酸药物制备方法制得；其中，所述致病基因为致癌基因，所述抗病基因为抑制抗癌基因。
8.根据权利要求7所述的治疗癌症的核酸药物，其特征在于，所述致癌基因包括Kras；所述抑制抗癌基因包括TP53。
9.根据权利要求7所述的治疗癌症的核酸药物，其特征在于，所述癌症包括结肠癌、肺癌。
10.根据权利要求7所述的治疗癌症的核酸药物，其特征在于，所述治疗癌症的核酸药物为如SEQ ID NO.3所示的第一序列和如SEQ ID NO.4所示的第二序列的杂合体。
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【技术特征摘要】
1.一种基于拟微小rna与小激活rna的核酸药物制备方法，其特征在于，所述核酸药物制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于拟微小rna与小激活rna的核酸药物制备方法，其特征在于，所述拟微小rna单链寡核苷酸片段为一段21-nt长度的拟微小rna单链寡核苷酸片段，以实现特异性地结合于所述致病基因的3′-端非翻译区域，从而抑制其表达和功能。
3.根据权利要求1所述的基于拟微小rna与小激活rna的核酸药物制备方法，其特征在于，根据所述抗病基因的mrna序列，设计小激活rna片段的步骤包括以下过程：
4.根据权利要求3所述的基于拟微小rna与小激活rna的核酸药物制备方法，其特征在于，应用自动搜索程序，通过使用美国国家生物技术信息中心的序列同源性比对搜索工具，对所设计的sarna反义链进行分析，以预测其与靶基因启动子特异性结合的概率；若发现可能存在或发生非特异性结合，须重新设计sarna序列。
5.一种治疗急性心肌梗死疾病的核酸药物，其特征在于，所述治疗急性心肌梗...
【专利技术属性】
技术研发人员：王志国，
申请(专利权)人：广东科心药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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