【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体地说，涉及一种cd33特异性单克隆抗体及其应用。
技术介绍
1、一、cd33抗体和抗体耦联药物发展历史：
2、cd33是一种在造血细胞中表达的膜糖蛋白，cd33是67kd糖基化跨膜蛋白，属于siglec家族。在交联或者配体结合后激活，介导抑制信号，调节细胞内钙动员、细胞粘附、白血病细胞凋亡、髓系细胞成熟和细胞因子的产生等，与某些血液肿瘤的发生和发展相关。
3、gentuzumab ozogamicin (mylotarg, cma-676; wyeth laboratories,philadelphia, pennsylvania)，是人igg4 cd33单克隆抗体（hp67.6）偶联calicheamicin衍生物，dar为2-3，包含约50%裸抗。2017年9月被fda批准用于成人新确诊的cd33阳性急性髓细胞白血病（aml）、成人复发或难治性aml和2岁及儿科患者的aml。
4、抗cd33单克隆抗体（如gemtuzumab ozogamicin）最早用于急性髓系白血病（aml）治疗。其抗体耦联药物（adcs）则结合了cd33抗体和细胞毒素，目的是实现更精准的治疗效果。cd33抗体克隆10c8则可以用于治疗乙型肝炎。
5、二、神经内分泌肿瘤的治疗困境：
6、神经内分泌肿瘤（nets）是一类来源于神经内分泌细胞的罕见肿瘤，可发生在全身各处，包括消化系统、呼吸系统和其他器官。目前，神经内分泌肿瘤针对某些药物的治疗出现了耐药性问题，而且神经内分
7、三、目前的局限性：
8、耐药性问题：神经内分泌前列腺癌患者可能出现对抗体或毒素的耐药性，限制了治疗效果。
9、非特异性毒性：adcs会对正常细胞产生毒性反应，导致不良副作用。
10、免疫原性：神经内分泌前列腺癌患者可能对外源抗体产生免疫反应，降低疗效。
11、适应症：目前只有针对血液肿瘤和乙型肝炎的抗体，没有针对实体肿瘤的治疗效果。而且目前的adc使用原理是靶向表达cd33的免疫细胞。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种cd33特异性单克隆抗体及其应用。本专利技术将cd33重组蛋白作为免疫原，通过免疫兔，产生针对cd33唾液酸结合区域的阻断性抗体，直接阻断cd33的免疫抑制作用。并利用此抗体治疗神经内分泌肿瘤。本专利技术是通过持续的研究和创新，cd33抗体及抗体耦联药物有望在克服当前的局限性和挑战的过程中，为实体肿瘤等疾病的治疗带来更多的希望和机遇。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、<第一方面>
4、本专利技术提供了一种cd33特异性单克隆抗体，由cd33蛋白或包含cd33蛋白的重组cd33蛋白免疫获得，所述cd33蛋白具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。
5、作为本专利技术的一个实施方案，所述重组cd33蛋白还包含如seq id no.2所示氨基酸序列的flag标签，所述重组cd33蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
6、作为本专利技术的一个实施方案，所述cd33特异性单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4，重链可变区序列如seq id no.5；或轻链可变区氨基酸序列如seq idno.6，重链可变区序列如seq id no.7。
7、在本专利技术中，所述cd33特异性单克隆抗体可以有2株，分别记为dt7787-1-1m3c3和dt7787-1-1m1d3。dt7787-1-1m3c3的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4，dt7787-1-1m3c3的重链可变区序列如seq id no.5；dt7787-1-1m1d3的轻链可变区氨基酸序列如seqid no.6，dt7787-1-1m1d3的重链可变区序列如seq id no.7。
8、作为本专利技术的一个实施方案，所述cd33蛋白具有如下结构特征：
9、cd33-human protein length=364 mw=39817.9 pi=8.48。
10、<第二方面>
11、本专利技术提供了一种上述所述cd33特异性单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
12、步骤一、抗原制备与免疫：由293t细胞表达，并经flag标签纯化cd33蛋白获得cd33重组蛋白，将其与佐剂混合，注射到蛋白免疫兔体内，激发免疫反应；
13、步骤二、多次免疫：免疫兔接受多次cd33重组蛋白的免疫，增强免疫系统对cd33的反应；定期采集血样，测量抗体水平和评估抗体对cd33的特异性；
14、步骤三、抗体收集及纯化：采集兔子的血液样本，离心分离出含有cd33特异性抗体的血浆；纯化获得cd33阻断性抗体。
15、作为本专利技术的一个实施方案，所述步骤一中，初次免疫时与cd33重组蛋白混合的佐剂为完全弗式佐剂。
16、作为本专利技术的一个实施方案，所述步骤二中，后续的多次免疫时，将cd33重组蛋白与不完全弗式佐剂混合，再注射到免疫兔体内。
17、作为本专利技术的一个实施方案，所述步骤三中，采用亲和柱对cd33特异性单克隆抗体进行纯化。
18、作为本专利技术的一个实施方案，所述制备方法具体包括如下步骤：
19、步骤一、选择cd33作为目标抗原：cd33（细胞贴附分子33）作为一种具有特定免疫原性的膜蛋白，在造血系统中广泛表达。明确cd33蛋白结构之后，明确cd33蛋白的唾液酸结合结构域是起到功能的关键结构域。
20、步骤二、抗原制备及免疫：利用293 t细胞表达，flag磁珠提纯的cd33蛋白，并确保其纯度和活性。将cd33蛋白与佐剂（除首次使用frdbior完全佐剂外，以后全部用frdbior不完全佐剂）混合，然后注射到蛋白免疫兔体内，以激发免疫反应。
21、步骤三、多次免疫：免疫兔需要接受多次cd33抗原的免疫，以增强免疫系统对cd33的反应。定期采集血样，测量抗体水平和评估抗体对cd33的特异性。
22、步骤四、抗体收集及纯化：对抗体进行效价检测，免疫后第14天测定值最高。通过采集兔子的血液样本，离心分离出含有cd33特异性抗体的血浆；进行抗体的纯化步骤，以获得高纯度的cd33特异性抗体，可供后续实验使用。
23、<第三方面>
24、本专利技术提供了一种cd33特异性单克隆抗体在制备特异性阻断cd33蛋白药物中的应用。
25、<第四方面>
26、本专利技术提供了一种cd33特异性单克隆抗体在制备治疗神经内分泌肿瘤药物中的应用。本专利技术的cd33阻断性抗体能够提高巨噬细胞对神经内分泌肿瘤细胞的吞噬效率。
27、作为本专利技术的一个实施方案，所述cd33特异性单克隆抗体在治疗神经本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CD33特异性单克隆抗体，其特征在于，由CD33蛋白或包含CD33蛋白的重组CD33蛋白免疫获得，所述CD33蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2.根据权利要求1所述的CD33特异性单克隆抗体，其特征在于，所述重组CD33蛋白还包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的flag标签，所述重组CD33蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
3.根据权利要求1所述的CD33特异性单克隆抗体，其特征在于，其制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的CD33特异性单克隆抗体，其特征在于，步骤一中，初次免疫时与CD33重组蛋白混合的佐剂为完全弗式佐剂。
5.根据权利要求3所述的CD33特异性单克隆抗体，其特征在于，步骤二中，后续的多次免疫时，将CD33重组蛋白与不完全弗式佐剂混合，再注射到免疫兔体内。
6.根据权利要求3所述的CD33特异性单克隆抗体，其特征在于，步骤三中，采用亲和柱对CD33阻断性抗体进行纯化。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的CD33特异性单克隆抗体在制备特异性阻
8.一种如权利要求1-6任一项所述的CD33特异性单克隆抗体在制备治疗神经内分泌肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述神经内分泌肿瘤包括神经内分泌前列腺癌。
...【技术特征摘要】
1.一种cd33特异性单克隆抗体，其特征在于，由cd33蛋白或包含cd33蛋白的重组cd33蛋白免疫获得，所述cd33蛋白具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；
2.根据权利要求1所述的cd33特异性单克隆抗体，其特征在于，所述重组cd33蛋白还包含如seq id no.2所示氨基酸序列的flag标签，所述重组cd33蛋白的氨基酸序列如seq idno.3所示。
3.根据权利要求1所述的cd33特异性单克隆抗体，其特征在于，其制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的cd33特异性单克隆抗体，其特征在于，步骤一中，初次免疫时与cd33重组蛋白混合的佐剂为完全弗式佐剂。...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱鹤，陈新宇，张凯，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：
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