【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物，涉及一种rsv融合前f蛋白的突变体及其制备和应用。
技术介绍
1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是一种高度传染性的呼吸道病原体，是全世界6个月以下婴儿住院和死亡的主要原因之一，能引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者严重的下呼吸道感染。who关于儿童急性呼吸道感染的病因学研究表明，rsv引发的急性呼吸道感染病例数占儿童呼吸道疾病总数的60％以上。2019年全球0-5岁儿童中发生了3300万例由rsv感染引起的急性下呼吸道感染(alri)，360万例患儿因此入院治疗，入院群体中共10.1万例患儿最终死亡，其中0-6月龄的婴儿死亡人数约占46％，给各国公共卫生资源造成了巨大的经济负担。
2、rsv属于副粘病毒科，该病毒基因组由15,200个核苷酸组成，包含由10个基因，编码11种蛋白。其中，结构蛋白中包含3种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白g(glycoprotein,g)、融合蛋白f(fusion protein，f)和小疏水蛋白sh(small hydrophobic protein，sh)。融合蛋白f和附着蛋白g这两种跨膜表面糖蛋白是中和抗体的关键靶点。然而，高度可变的糖基化附着蛋白g和融合蛋白f的构象变化给疫苗开发带来了挑战。
3、融合蛋白f为i型膜融合蛋白，病毒编码的f0蛋白在内质网中形成三聚体，并且含有两个furin(弗林)蛋白酶切位点，经过furin蛋白酶切后能够形成f1、f2两个蛋白和一个pep27多肽片段，f1蛋白含有其n-末端的疏水融
4、目前，已经解析了f蛋白两种构象的晶体结构，并基于其分子结构，通过点突变获得了几种pre-f构象相对稳定的突变体。如：cn105473604b、us10017543b2、us11130785b2中描述的包含ds-cav1突变体(s155c，s290c，s190f，v207l)；us20150320854a1、wo2014174018a1、au2014259474b2、cn105408348b中描述的包含sc-dm和sc-tm的pre-f稳定突变体(n67i，s215p，e487q)；us20210023200a1、cn108738312a中描述的pre-f突变体(s55c，l188c，l142c，n371c)；cn114929877a中描述的包含l141c、l142c和l373c位置突变的pre-f突变体。传统的突变策略主要包括二硫键突变、空腔填充或电荷平衡，其目的在于维持pre-f的稳定化构象或提高pre-f的表达水平。然而，pre型f蛋白的稳定化仍是不充分的，基于结构的优化在持续研究中。
5、有鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
1、本申请实施例的主要目的是一种rsv融合前f蛋白的突变体及其制备和应用。技术方案包括：
2、在本申请实施例的第一方面，提供一种rsv融合前f蛋白的突变体，其f1多肽的α3螺旋区域具有半胱氨酸取代基1，β3片层区域具有半胱氨酸取代基2，所述半胱氨酸取代基1和半胱氨酸取代基2形成二硫键。
3、在本申请的一些实施方式中，所述rsv融合前f蛋白的物种来源为人或者牛。
4、在本申请的一些实施方式中，所述rsv融合前f蛋白的f1多肽具有seq id no.51所示的氨基酸序列或者与seq id no.51所示的氨基酸序列存在至少80％的同源性。
5、在本申请的一些实施方式中，所述rsv融合前f蛋白的f1多肽的具有seq idno.51、seq id no.74或者seq id no.75所示的氨基酸序列。在本申请的一些实施方式中，所述的rsv融合前f蛋白的f1多肽满足如下条件中的一个或者多个：
6、(1)不含跨膜结构域，以及
7、(2)不含胞内结构域。
8、在本申请的一些实施方式中，所述的rsv融合前f蛋白的f1多肽具有如下突变中的一个或者多个：i379v和m447v。
9、在本申请的一些实施方式中，所述rsv融合前f蛋白的f1多肽具有seq id no.52所示的氨基酸序列。
10、在本申请的一些实施方式中，所述半胱氨酸取代基1和所述半胱氨酸取代基2之间的距离为
11、在本申请的一些实施方式中，所述突变体的f1多肽的α3螺旋区域具有如下突变中的一个或者多个：e163c、k166c、i167c、a170c，以及，l171c。
12、在本申请的一些实施方式中，所述突变体的f1多肽的β3片层区域具有如下突变中的一个或者多个：a177c、v179c，以及，l181c。
13、在本申请的一些实施方式中，所述突变体的f1多肽具有如下突变组合中的一组：
14、组1为e163c和l181c、
15、组2为k166c和v179c、
16、组3为i167c和v179c、
17、组4为a170c和v179c、
18、组5为a170c和a177c，以及，
19、组6为l171c和a177c。
20、在本申请的一些实施方式中，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：s55c、s155c、l188c、s190f、v207l，以及，s290c。
21、在本申请的一些实施方式中，所述突变体具有如下突变位点组合中的一组：
22、组1)s155c和s290c、
23、组2)s55c和l188c，以及，
24、组3)s190f和v207l。
25、在本申请的一些实施方式中，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。
26、在本申请的一些实施方式中，所述突变体不含pep27多肽，f2多肽的c端和所述f1多肽的n端以酰胺键直接连接或者通过柔性短肽间接连接。
27、在本申请的一些实施方式中，可选地，所述柔性短肽为gs、g、s、gs、sg、ss、gg、pg、ggg、ggs、sss、gsg、sgs、gpg、gsgs、gggs、gpgs、gggg、gsgg、ggsg、sggg、gssg、sgsg、gssg、ggpgg或者ggggs。
28、在本申请的一些实施方式中，所述突变体的f1多肽的c端连接标签片段和/或聚集基序。
29、在本申请的一些实施方式中，所述标签片段包括6his多肽。
30、在本申请的一些实施方式中，所述聚集基序如seq id no.48所示。
31、在本申请的一些实施方式中，所述突变本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.RSV融合前F蛋白的突变体，其F1多肽的α3螺旋区域具有半胱氨酸取代基1，β3片层区域具有半胱氨酸取代基2，所述半胱氨酸取代基1和半胱氨酸取代基2形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述RSV融合前F蛋白的物种来源为人或者牛。
3.根据权利要求2所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述RSV融合前F蛋白的F1多肽具有SEQ ID NO.51所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO.51所示的氨基酸序列存在至少80％的同源性；
4.根据权利要求1至3中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述半胱氨酸取代基1和所述半胱氨酸取代基2之间的距离为
5.根据权利要求4所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体的F1多肽的α3螺旋区域具有如下突变中的一个或者多个：E163C、K166C、I167C、A170C，以及，L171C。
6.根据权利要求4所述的RSV融合前F蛋白突变体，其中，所述突变体的F1多肽的β3片层区域具有如下突变中的一个或者多个：A177C、V179C，
7.根据权利要求1至3、5以及6中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体的F1多肽具有如下突变组合中的一组：
8.根据权利要求7所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：S55C、S155C、L188C、S190F、V207L以及，S290C。
9.根据权利要求8所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体具有如下突变位点组合中的一组：
10.根据权利要求1至3、5至6以及8至9中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。
11.根据权利要求10所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体不含pep27多肽，F2多肽的C端和所述F1多肽的N端以酰胺键直接连接或者通过柔性短肽间接连接；
12.根据权利要求11所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体的F1多肽的C端连接标签片段和/或聚集基序；
13.根据权利要求10所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体的F2多肽具有SEQ ID NO.49所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO.49所示的氨基酸序列存在至少80％的同源性；
14.根据权利要求1至3、5至6、8至9以及11至13中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体，其中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQID NO.39、SEQ ID NO.42至SEQ ID NO.47以及SEQ ID NO.53至SEQ ID NO.73中的任一所示。
15.核酸分子，其编码权利要求1至14中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体。
16.载体，其包括权利要求15所述的核酸分子。
17.工程细胞，其表达权利要求1至14中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体，或者其包括权利要求15所述的核酸分子或者权利要求16所述的载体。
18.权利要求1至14中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体的生产方法，其包括如下步骤：
19.免疫组合物，其包括权利要求1至14中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体、或者权利要求15所述的核酸分子，以及免疫佐剂；
20.权利要求1至14中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体在制备呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒中的应用。
21.呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，其包括权利要求1至14中任一项所述的RSV融合前F蛋白的突变体。
...【技术特征摘要】
1.rsv融合前f蛋白的突变体，其f1多肽的α3螺旋区域具有半胱氨酸取代基1，β3片层区域具有半胱氨酸取代基2，所述半胱氨酸取代基1和半胱氨酸取代基2形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述rsv融合前f蛋白的物种来源为人或者牛。
3.根据权利要求2所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述rsv融合前f蛋白的f1多肽具有seq id no.51所示的氨基酸序列或者与seq id no.51所示的氨基酸序列存在至少80％的同源性；
4.根据权利要求1至3中任一项所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述半胱氨酸取代基1和所述半胱氨酸取代基2之间的距离为
5.根据权利要求4所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述突变体的f1多肽的α3螺旋区域具有如下突变中的一个或者多个：e163c、k166c、i167c、a170c，以及，l171c。
6.根据权利要求4所述的rsv融合前f蛋白突变体，其中，所述突变体的f1多肽的β3片层区域具有如下突变中的一个或者多个：a177c、v179c，以及，l181c。
7.根据权利要求1至3、5以及6中任一项所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述突变体的f1多肽具有如下突变组合中的一组：
8.根据权利要求7所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：s55c、s155c、l188c、s190f、v207l以及，s290c。
9.根据权利要求8所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述突变体具有如下突变位点组合中的一组：
10.根据权利要求1至3、5至6以及8至9中任一项所述的rsv融合前f蛋白的突变体，其中，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。
11.根据权利要求10所...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔保峰，胡浩，蒋浩然，滕忠坤，周茹，王姗姗，王文宇，王婧，周翠云，郑海东，于旭博，
申请(专利权)人：苏州聚微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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