【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，具体为黄唇鱼鳍条细胞系的建立、鉴定方法及其在鱼类病毒学和免疫学中的应用。
技术介绍
1、黄唇鱼(bahaba flavolabiata)隶属硬骨鱼纲鲈形同石首鱼科，为近海暖温性底层肉食性鱼类，栖息于近海水深50-60m的海区，喜欢在淡水和海水的交汇河口海域生活。目前的数据表明，至少有4种病毒可以感染养殖和野生的黄唇鱼，这些病原体的感染通常与高死亡率事件有关。
2、世界动物卫生组织(oie)推荐的病毒鉴定金标准是细胞培养分离和事后鉴定。更重要的是，易感鱼细胞系对于疫苗开发、重组蛋白的生产是必需的，并且这些细胞系用作研究病毒病理学和免疫学的合适模型，目前大约有783种鱼类细胞系可供研究人员使用，尽管组织来源是多种多样的，但大多数鱼类细胞系是从鱼鳍和胚胎中获得的。
3、然而，只有2个大口黑鲈细胞系lbt-2来源于尾干和来源于卵巢的性腺细胞系。并且现有的这些细胞系不是商业上可获得的。无法大量有效的应用于疫苗开发、重组蛋白生产等领域，因此本专利技术提供一种黄唇鱼鳍条细胞系的建立、鉴定方法及其在鱼类病毒学和免疫学中的应用。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供黄唇鱼鳍条细胞系的建立、鉴定方法及其在鱼类病毒学和免疫学中的应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题，本专利技术可以从黄唇鱼的鳍条组织中获得永生细胞系，并且新建立的细胞系对许多鱼类病毒高度敏感，可用于未来的遗传学、病毒学和免疫学研究。
2、为了实现上述目的，
3、一种黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，该建立方法的流程如下：无菌剪切黄唇鱼的鳍条组织进行洗涤；洗涤后，用剪刀将组织切碎，用胰蛋白酶edta溶液的混合物分散成单个细胞，悬浮液进行网筛过滤，将细胞进行多次洗涤，然后转移到组织培养瓶中进行孵育；定期更换部分培养基，直到迁移的细胞形成汇合的单层，培养单层细胞，继代培养直至停止使用抗生素。
4、进一步的，还包括超低温保存和复苏过程：黄唇鱼鳍条细胞在多次传代后冷冻保存；细胞被传代培养并生长至汇合，进行离心处理；将沉淀的细胞悬浮在新鲜制备的冷冻液中观察培养基，然后将细胞悬液转移至在冷冻瓶中，最后转移到液氮中。
5、进一步的，所述复苏过程包括：将冷冻小瓶快速解冻，并将细胞逐滴混合在l-15完全培养基，再将试管进行离心处理，悬浮在l-15完全培养基中，并接种到细胞瓶中接种培养。
6、进一步的，l-15中添加胎牛血清、青霉素和链霉素；所述鳍条组织用青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲盐水洗涤。
7、一种黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，所述鉴定方法包括细胞生长速率分析、染色体分析、gfp报告基因转染、支原体污染的检测、细胞系的来源的确认、病毒敏感性分析、病毒滴度的测定、抗病毒免疫。
8、进一步的，所述细胞生长速率分析包括以下流程：采用细胞研究培养基、培养温度和胎牛血清浓度对细胞生长的影响；将bt细胞接种到培养瓶中，加入杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基，在播种后每天测量细胞增殖活性，并将每个试验条件下的三个重复烧瓶中的细胞胰蛋白酶化，并进行计数。
9、进一步的，所述gfp报告基因转染包括以下流程：将绿色荧光蛋白表达载体pegfp-n1转染到bt细胞中，并将已转染的黑头米诺鱼细胞在孔板接种，用无血清培养基洗涤单层一次，使用转染试剂将质粒加入细胞中；未转染质粒的细胞用作阴性对照；最后在荧光显微镜下观察细胞；
10、所述支原体污染的检测包括以下流程：检测支原体污染，bt细胞在培养基中进行培养；将上清液转移到微离心管中离心；将沉淀溶解在缓冲液中，在加热涡旋后再次离心，取上清液作为pcr的模板；反应中包括阳性和无模板对照；扩增产物在琼脂糖凝胶中分离。
11、进一步的，所述细胞系的来源的确认包括以下流程：对黄唇鱼的16s rrna和细胞色素氧化酶亚基-ⅰ基因进行部分扩增和测序，鉴定bt细胞系的来源；从bt细胞中分离模板dna，进行pcr扩增16s和coⅰ基因的部分片段；pcr的热循环，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色，使用紫外透射仪观察；从凝胶中切除扩增子，进行纯化并测序；对比已知的数据库序列。
12、进一步的，所述病毒滴度的测定包括以下流程：用感染了msrv、lmbv、isknv、svcv、tilv和gcrv-i的bt细胞中的细胞培养上清液检测tcid50；制备连续稀释液，同时将培养板接种bt细胞悬液；然后将含有病毒或上清液每稀释接种；清空孔后在所有试验孔和对照孔中加入培养基；培养皿孵育并观察平板，计算tcid50；
13、所述抗病毒免疫包括以下流程：在组织培养板中感染，检测bt细胞对病毒感染的免疫应答。
14、本专利技术的有益效果：
15、1.本专利技术可以从黄唇鱼的鳍条组织中获得永生细胞系，并且新建立的细胞系对许多鱼类病毒高度敏感，可以用于未来的遗传学、病毒学和免疫学研究。
16、2.该黄唇鱼鳍条细胞系主要由成纤维细胞样细胞组成，它们的核型显示大多数细胞在第60代具有二倍体数目，2n＝64。细胞色素氧化酶i和16s rrna基因的测序证实bt细胞来源于黄唇鱼。细胞系检测支原体污染，发现为阴性。bt细胞成功转染gfp报告基因，表明这些细胞可用于基因表达研究。
17、3.除nnv病毒外，所有受试病毒都能在bt细胞中复制。复制msrv，lmbv，isknv，svcv和tilv的效率范围为107.24至108.82tcid 50/ml，且仅用nnv感染诱导i型干扰素基因。
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1.黄唇鱼鳍条细胞系的应用，其特征在于：黄唇鱼鳍条细胞系应用于鱼类病毒学、遗传学和免疫学领域中，黄唇鱼鳍条细胞系还可以应用于水生动物保护和水产养殖技术领域。
2.一种黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于：该建立方法的流程如下：无菌剪切黄唇鱼的鳍条组织进行洗涤；洗涤后，用剪刀将组织切碎，用胰蛋白酶EDTA溶液的混合物分散成单个细胞，悬浮液进行网筛过滤，将细胞进行多次洗涤，然后转移到组织培养瓶中进行孵育；定期更换部分培养基，直到迁移的细胞形成汇合的单层，培养单层细胞，继代培养直至停止使用抗生素。
3.根据权利要求2所述的黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于，还包括超低温保存和复苏过程：黄唇鱼鳍条细胞在多次传代后冷冻保存；细胞被传代培养并生长至汇合，进行离心处理；将沉淀的细胞悬浮在新鲜制备的冷冻液中观察培养基，然后将细胞悬液转移至在冷冻瓶中，最后转移到液氮中。
4.根据权利要求3所述的黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于，所述复苏过程包括：将冷冻小瓶快速解冻，并将细胞逐滴混合在L-15完全培养基，再将试管进行离心处理，悬浮在L-15完全培养基中
5.根据权利要求2所述的黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于：L-15中添加胎牛血清、青霉素和链霉素；所述鳍条组织用青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲盐水洗涤。
6.一种黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括细胞生长速率分析、染色体分析、GFP报告基因转染、支原体污染的检测、细胞系的来源的确认、病毒敏感性分析、病毒滴度的测定、抗病毒免疫。
7.根据权利要求6所述的黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，其特征在于，所述细胞生长速率分析包括以下流程：采用细胞研究培养基、培养温度和胎牛血清浓度对细胞生长的影响；将BT细胞接种到培养瓶中，加入杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基，在播种后每天测量细胞增殖活性，并将每个试验条件下的三个重复烧瓶中的细胞胰蛋白酶化，并进行计数。
8.根据权利要求6所述的黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，其特征在于，所述GFP报告基因转染包括以下流程：将绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1转染到BT细胞中，并将已转染的黑头米诺鱼细胞在孔板接种，用无血清培养基洗涤单层一次，使用转染试剂将质粒加入细胞中；未转染质粒的细胞用作阴性对照；最后在荧光显微镜下观察细胞；
9.根据权利要求6所述的黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，其特征在于，所述细胞系的来源的确认包括以下流程：对黄唇鱼的16S rRNA和细胞色素氧化酶亚基-Ⅰ基因进行部分扩增和测序，鉴定BT细胞系的来源；从BT细胞中分离模板DNA，进行PCR扩增16S和COⅠ基因的部分片段；PCR的热循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色，使用紫外透射仪观察；从凝胶中切除扩增子，进行纯化并测序；对比已知的数据库序列。
10.根据权利要求6所述的黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，其特征在于，所述病毒滴度的测定包括以下流程：用感染了MSRV、LMBV、ISKNV、SVCV、TiLV和GCRV-I的BT细胞中的细胞培养上清液检测TCID50；制备连续稀释液，同时将培养板接种BT细胞悬液；然后将含有病毒或上清液每稀释接种；清空孔后在所有试验孔和对照孔中加入培养基；培养皿孵育并观察平板，计算TCID50；
...【技术特征摘要】
1.黄唇鱼鳍条细胞系的应用，其特征在于：黄唇鱼鳍条细胞系应用于鱼类病毒学、遗传学和免疫学领域中，黄唇鱼鳍条细胞系还可以应用于水生动物保护和水产养殖技术领域。
2.一种黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于：该建立方法的流程如下：无菌剪切黄唇鱼的鳍条组织进行洗涤；洗涤后，用剪刀将组织切碎，用胰蛋白酶edta溶液的混合物分散成单个细胞，悬浮液进行网筛过滤，将细胞进行多次洗涤，然后转移到组织培养瓶中进行孵育；定期更换部分培养基，直到迁移的细胞形成汇合的单层，培养单层细胞，继代培养直至停止使用抗生素。
3.根据权利要求2所述的黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于，还包括超低温保存和复苏过程：黄唇鱼鳍条细胞在多次传代后冷冻保存；细胞被传代培养并生长至汇合，进行离心处理；将沉淀的细胞悬浮在新鲜制备的冷冻液中观察培养基，然后将细胞悬液转移至在冷冻瓶中，最后转移到液氮中。
4.根据权利要求3所述的黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于，所述复苏过程包括：将冷冻小瓶快速解冻，并将细胞逐滴混合在l-15完全培养基，再将试管进行离心处理，悬浮在l-15完全培养基中，并接种到细胞瓶中接种培养。
5.根据权利要求2所述的黄唇鱼鳍条细胞系的建立方法，其特征在于：l-15中添加胎牛血清、青霉素和链霉素；所述鳍条组织用青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲盐水洗涤。
6.一种黄唇鱼鳍条细胞系的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括细胞生长速率分析、染色体分析、gfp报告基因转染、支原体污染的检测、细胞系的来源的确认、病毒敏感性分析、病毒滴度的测定、抗病毒免疫。
7.根据权利要求6所...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗素君，陆丙乾，胡玉婷，陆昌胜，黄建强，刘文瑜，酆伟，戴国贤，周永东，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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