【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及融合酶，具体涉及一种高稳定性融合酶的制备方法及其应用。
技术介绍
1、随着医疗技术的不断发展，医疗器械的种类和数量不断增加，对医用清洗剂的需求也日益增长。传统医用清洗剂存在去污能力弱、易产生泡沫、易导致清洗不彻底等问题，难以满足现代医疗清洗的需求。酶类医用清洗剂因其优异的清洗效果和环保性能，逐渐成为医用清洗剂市场的主流产品。
2、为了提高酶类医用清洗剂的清洗效果，一种清洗剂中通常含有多种不同的酶，如蛋白酶用于分解蛋白质类污渍（血液、组织液等）、脂肪酶用于分解脂肪类污渍、淀粉酶用于分解淀粉类污渍、纤维素酶用于分解纤维素类污渍，等等。但添加有多种酶的复合酶医用清洗剂也存在一些问题，其使用的医用酶制剂是酶制剂领域内制备要求最为严苛的一类。其制备标准不仅远超其他酶类，具体体现在对菌落含量、气味、颜色以及重金属含量等指标的严格控制上，同时，对酶液的稳定性也具有严格的要求。
3、作为复合酶医用清洗剂中的主要作用成分，复合酶的稳定性直接决定了清洗剂的清洗效果。复合酶在清洗剂中的稳定性不仅表现为热稳定性，还表现为对清洗剂中表面活性剂、漂白剂、螯合剂等的稳定性。例如，医用清洗剂中采用的低泡表面活性剂，经过低泡改性处理后，其物理与化学性状发生了显著变化，不再对酶制剂友好，反而对酶制剂有较强的破坏作用，这可能严重影响到酶制剂在清洗过程中的稳定性和效能。此外，复配成复合酶的不同酶之间，也会产生相互影响，尤其是蛋白酶会水解和破坏其他酶。
4、因此，开发一种在医用清洗剂中具有强稳定性的复合酶，成为一个亟待解
技术实现思路
1、为了解决现有技术中医用清洗剂使用的复合酶稳定性差的问题，本专利技术提供了一种高稳定性融合酶的制备方法及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、第一方面，本申请提供一种高稳定性融合酶的制备方法，采用的技术方案如下：
4、一种高稳定性融合酶的制备方法，包括以下步骤：
5、s1：分别构建碱性蛋白酶突变基因、碱性淀粉酶突变基因和碱性脂肪酶突变基因；
6、s2：将所述碱性蛋白酶突变基因、碱性淀粉酶突变基因和碱性脂肪酶突变基因连接到多基因共表达载体pqlinkh，得到重组载体；
7、s3：转化到大肠杆菌dh5α表达菌株，得到重组菌株；
8、s4：接种到培养基，发酵，分离纯化，得到融合酶；
9、s5：对融合酶进行化学修饰；
10、s6：微胶囊化，得到高稳定性融合酶。
11、优选的，s1中，所述碱性蛋白酶突变基因的构建方法包括：
12、选择能表达碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌作为出发菌株，制备原生质体，紫外诱变处理，菌株筛选，得到高产碱性蛋白酶的突变菌株，提取基因组dna，pcr得到碱性蛋白酶突变基因，基因测序，对基因序列的密码子进一步优化改造，得到碱性蛋白酶突变基因序列，人工合成碱性蛋白酶突变基因。
13、优选的，s1中，所述碱性淀粉酶突变基因的构建方法包括：
14、选择能表达碱性淀粉酶的蜡样芽孢杆菌作为出发菌株，制备原生质体，紫外诱变处理，菌株筛选，得到高产碱性淀粉酶的突变菌株，提取基因组dna，pcr得到碱性淀粉酶突变基因，基因测序，对基因序列的密码子进一步优化改造，得到碱性淀粉酶突变基因序列，人工合成碱性淀粉酶突变基因。
15、优选的，s1中，所述碱性脂肪酶突变基因的构建方法包括：
16、选择能表达碱性脂肪酶的枯草芽孢杆菌作为出发菌株，制备原生质体，紫外诱变处理，菌株筛选，得到高产碱性脂肪酶的突变菌株，提取基因组dna，pcr得到碱性脂肪酶突变基因，基因测序，对基因序列的密码子进一步优化改造，得到碱性脂肪酶突变基因序列，人工合成碱性脂肪酶突变基因。
17、优选的，s5中，对融合酶进行化学修饰包括如下步骤：
18、以马来酸酐为修饰剂，在融合酶液中加入100ug/ml的马来酸酐，25℃、200r/min搅拌8小时。
19、优选的，s6中，所述微胶囊化包括如下步骤：
20、将经过化学修饰的融合酶进行冷冻干燥，得到融合酶粉，使用脂肪酸和聚阴离子多糖为包裹层将所述融合酶粉包裹，得到微胶囊化的融合酶。
21、优选的，所述碱性蛋白酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述碱性淀粉酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述碱性脂肪酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
22、第二方面，本申请提供一种高稳定性融合酶，采用的技术方案如下：
23、一种高稳定性融合酶，其是根据上述一种高稳定性融合酶的制备方法制备得到的。
24、优选的，所述高稳定性融合酶同时具有碱性蛋白酶、碱性淀粉酶和碱性脂肪酶的活性。
25、优选的，所述一种高稳定性融合酶在医用清洗剂中的应用，所述医用清洗剂用于洗涤医疗器械、操作台面、医生工作服、病患服等。
26、综合以上技术方案，本申请具有以下有益效果：
27、1.本专利技术分别对产碱性蛋白酶、碱性淀粉酶及碱性脂肪酶的菌株进行紫外诱变并筛选相应酶的高表达菌株，用pcr扩增高表达菌株中相应酶的突变基因，并利用大肠杆菌对密码子的偏好型对突变基因的序列进行优化，最终得到三种酶的突变基因，实现相应酶的稳定和高效表达，从根本上提高融合酶中每种酶的表达量及稳定性。
28、2.本专利技术采用基因工程技术手段，构建三种基因的共表达载体，将所要复合的三种酶的突变基因同时构建在同一表达载体上，再转化到同一表达菌株中进行整体表达，通过菌体自身的协调、整合、修复等功能，一次性表达出所需的融合酶，且经过菌体的整合作用，其他酶与蛋白酶已融为一体，此时的蛋白酶已不再攻击其他共存的酶制剂，增强了融合酶的稳定性。
29、3.本专利技术对共表达的融合酶进行蛋白质体外修饰，进一步增强酶的稳定性和催化性能。
30、4.本专利技术采用微胶囊技术对化学修饰的融合酶进行包裹，可抵抗清洗液中其他化学物质对酶的破坏。
31、总之，本专利技术通过紫外诱变、基因工程技术和体外化学修饰，极大的提高了融合酶的表达量和稳定性，同时利用微胶囊技术，降低了清洗剂中其他化学成分对融合酶的破坏作用，从而形成一款稳定性高且适用于医用清洗剂的融合酶。
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1.一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，S1中，所述碱性蛋白酶突变基因的构建方法包括：
3.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，S1中，所述碱性淀粉酶突变基因的构建方法包括：
4.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，S1中，所述碱性脂肪酶突变基因的构建方法包括：
5.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，S5中，对融合酶进行化学修饰包括如下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，S6中，所述微胶囊化包括如下步骤：
7.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述碱性淀粉酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述碱性脂肪酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.一种高稳定性融合酶，其特
9.根据权利要求8所述的一种高稳定性融合酶，其特征在于，所述高稳定性融合酶同时具有碱性蛋白酶、碱性淀粉酶和碱性脂肪酶的活性。
10.权利要求8或9中所述的一种高稳定性融合酶在医用清洗剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，s1中，所述碱性蛋白酶突变基因的构建方法包括：
3.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，s1中，所述碱性淀粉酶突变基因的构建方法包括：
4.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，s1中，所述碱性脂肪酶突变基因的构建方法包括：
5.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，s5中，对融合酶进行化学修饰包括如下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种高稳定性融合酶的制备方法，其特征在于，s6中，所述微胶囊...
【专利技术属性】
技术研发人员：王仁，
申请(专利权)人：南京永正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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