一种WRN蛋白解旋酶结构域结晶的方法技术

本发明专利技术属于蛋白晶体培养技术领域，具体涉及一种WRN蛋白解旋酶结构域结晶的方法。本发明专利技术通过昆虫细胞表达体系重组表达WRN解旋酶蛋白，通过一系列亲和层析纯化方法对目的蛋白进行分离和纯化；获得性质均一的目的蛋白后，加入小分子和金属离子进行孵育，形成蛋白‑小分子‑金属离子复合物；后续使用基于气相扩散原理的结晶方法结合点样机器人进行蛋白复合物单晶培养，共进行1000种以上的不同结晶条件筛选，最后筛选出蛋白复合物晶体的结晶条件。利用拍照系统观察蛋白质晶体的形貌，衍射优化后蛋白晶体，获取衍射数据并解析其晶体结构。本发明专利技术设置的WRN蛋白解旋酶结构域和小分子/金属离子组合可以稳定重复出高质量的蛋白晶体，且晶体的分辨率高，可以达到1.9Å。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白晶体培养，具体涉及一种wrn蛋白解旋酶结构域结晶的方法。

技术介绍

1、wrn蛋白是dna解旋酶recq家族的成员，可以解旋复制和重组过程中可能遇到的非规范性二级dna结构。wrn蛋白由1432个氨基酸残基组成，分子量为160kd。从n端到c端主要有5个结构域：核酸外切酶结构域、解螺旋酶（或atp酶）结构域、recq碳末端（recq c-terminal，rqc）结构域、解螺旋酶核糖核酸酶d碳末端（helicase-and-ribonuclease d/c-terminal，hrdc）结构域、核定位信号（nuclear localization signal，nls）。

2、目前，已有多个人类wrn片段以及相关复合物的三维结构获得了解析。在wrn蛋白的n末端是一个核酸外切酶（exonuclease）区域，该结构域使得wrn蛋白与核酸结构相互作用，该wrn蛋白是人类recq解旋酶家族中唯一具有3’-5’核酸外切酶活性的成员。该蛋白还具有一个解旋酶（helicase）结构域，能结合并水解atp，从而在atp的供能下解开双链dna。本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种WRN蛋白解旋酶结构域结晶的方法，其特征在于：该方法包括制备步骤：1）WRN蛋白片段的设计和改造；2）WRN_517-945蛋白表达和纯化；3）WRN_517-945蛋白晶体培养；4）WRN_517-945结构解析；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）所述的WRN_517-1093包含解旋酶结构域和RQC结构域。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述的WRN_517-945蛋白表达和纯化，包括：1）融合标签以及酶切位点序列的添加；2）WRN_517-945蛋白表达；3）WRN_517-945蛋白大量表达纯化。

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【技术特征摘要】

1.一种wrn蛋白解旋酶结构域结晶的方法，其特征在于：该方法包括制备步骤：1）wrn蛋白片段的设计和改造；2）wrn_517-945蛋白表达和纯化；3）wrn_517-945蛋白晶体培养；4）wrn_517-945结构解析；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）所述的wrn_517-1093包含解旋酶结构域和rqc结构域。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述的wrn_517-945蛋白表达和纯化，包括：1）融合标签以及酶切位点序列的添加；2）wrn_517-945蛋白表达；3）wrn_517-945蛋白大量表达纯化。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述融合标签以及酶切位点序列的添加，其中，wrn_517-945蛋白n端融合有6×his标签序列和hrv 3c蛋白酶酶切割位点序列。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述wrn_517-945蛋白表达，包括：1）基因合成及质粒构建；2）wrn_517-945蛋白小量表达测试。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：wrn_517-945蛋白表达的载体为昆虫表达载体pfastbac1。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述基因合成及质粒构建，包括步骤：将wrn_517-945蛋白序列对应基因合成，获得基因模板后通过聚合酶链式反应进行扩增，使用同源重组的方法连接至昆虫表达载体pfastbac1，然后使用热激法转化到大肠杆菌bl21（de3）涂布平板，挑取单克隆，通过聚合酶链式反应鉴定阳性的送测序，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨银龙，傅蓝德，程洪金，孙轩，陈荣昌，贾明，
申请(专利权)人：苏州青云瑞晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：