【技术实现步骤摘要】
本申请属于基因测序，尤其涉及一种rna亲和纯化测序方法。
技术介绍
1、rna结合蛋白(rna-binding protein,rbp)是具有一类或多个rna结合域的蛋白，这类蛋白质通过和rna的结合来改变rna结构、表达效率和功能。目前rna与蛋白质相互作用的研究技术主要有rip-seq和clip-seq等。rip-seq和clip-seq需要进行体内实验，使用有毒试剂进行固定，成功率低，对人体有害，通量低，且需要特异性抗体来满足实验需求，限制了技术的普适性。且上述技术实验还存在周期长，重复性差，对抗体的要求高，无法特异进行rna互作研究等问题，给这些技术的实际应用带来了诸多不便。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本申请提供了一种安全性更高、体外、高通量、普适性更高的rna亲和纯化测序方法。
2、为了实现上述专利技术目的，本申请提供以下技术方案：
3、本申请提供了一种rna亲和纯化测序方法，包括如下步骤：
4、(1)提取目标样本的总rna；
5、(2)对总rna进行rrna去除，收集mrna、lncrna和circrna；
6、(3)构建rna结合蛋白表达载体；
7、(4)对rna结合蛋白表达载体进行体外蛋白表达，得到表达产物；
8、(5)使用标签蛋白纯化磁珠对所述表达产物进行纯化，得到纯化产物；
9、(6)将纯化产物与步骤(2)收集得到的rna结合，依次进行孵育、洗脱，得到亲和
10、(7)对亲和纯化后的rna依次进行文库构建、pcr扩增、测序，即可。
11、可选地，步骤(2)中，所述收集mrna、lncrna和circrna采用探针进行。
12、在本申请中，通过实验收集rna后，再将rna与rna结合蛋白结合，测序数据量要求更低，减少了测序、分析的成本。
13、可选地，步骤(3)包括：
14、s1、选取rna结合蛋白的编码基因；
15、s2、根据rna结合蛋白的编码基因的cds序列设计pcr扩增引物；
16、s3、使用pcr扩增引物扩增rna结合蛋白目的片段；
17、s4、通过无缝克隆将rna结合蛋白目的片段构建到蛋白表达载体上；
18、s5、将构建完成的蛋白表达载体转化到大肠杆菌中进行培养；
19、s6、挑取单克隆菌落进行鉴定和测序，筛选出与rna结合蛋白目的片段序列一致的表达载体，得到表达载体菌株；
20、s7、对表达载体菌株进行质粒提取，即得rna结合蛋白表达载体。
21、可选地，步骤s2中，所述rna结合蛋白的编码基因的cds序列如seq id no.1所示。
22、可选地，步骤s2中，所述pcr扩增引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
23、可选地，步骤s4中，所述蛋白表达载体的初始表达载体为pt7sp6。
24、可选地，所述蛋白表达载体带有halo标签；
25、所述halo标签的上游序列如seq id no.4所示；
26、所述halo标签的下游序列如seq id no.5所示。
27、可选地，步骤(4)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：28～32μl的tnt mix，0.8～1.2μl的rna结合蛋白表达载体，无酶水补至50μl。
28、优选地，步骤(4)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：30μl的tnt mix，1μl的rna结合蛋白表达载体，无酶水补至50μl。
29、可选地，所述体外蛋白表达的温度为28～32℃；
30、所述体外蛋白表达的时间为1.8～2.2h。
31、可选地，所述体外蛋白表达的温度独立地选自28℃、29℃、30℃、31℃、32℃中的任意值或任意两者之间的范围值。
32、可选地，所述体外蛋白表达的时间独立地选自1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h中的任意值或任意两者之间的范围值。
33、可选地，步骤(5)中，所述标签蛋白纯化磁珠为halo标签蛋白纯化磁珠。
34、在本申请中，使用标签蛋白纯化磁珠纯化蛋白，提高了实验效率。
35、可选地，步骤(6)中，所述孵育的时间为1.8～2.2h。
36、可选地，步骤(6)中，所述孵育的时间独立地选自1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h中的任意值或任意两者之间的范围值。
37、可选地，步骤(7)中，所述文库构建包括第一链cdna的合成、第二链cdna的合成、接头连接。
38、可选地，所述第一链cdna的合成的反应体系为：16～18μl的fragmented rna，5～7μl的strand specificity reagent，1～3μl的1st strand enzyme mix；
39、所述第一链cdna的合成的反应程序为：24～26℃，8～12min→40～43℃，14～16min→68～72℃，14～16min→3～5℃，恒温孵育。
40、优选地，所述第一链cdna的合成的反应体系为：17μl的fragmented rna，6μl的strand specificity reagent，2μl的1st strand enzyme mix；
41、所述第一链cdna的合成的反应程序为：25℃，10min→42℃，15min→70℃，15min→4℃，恒温孵育。
42、可选地，所述第二链cdna的合成的反应体系为：24～26μl的1st strand cdna，28～32μl的2nd strand buffer，4～6μl的2nd strand enzyme master mix；
43、所述第二链cdna的合成的反应程序为：15～17℃，28～32min→71～73℃，14～16min→3～5℃，恒温孵育。
44、优选地，所述第二链cdna的合成的反应体系为：25μl的1st strand cdna，30μl的2nd strand buffer，5μl的2nd strand enzyme master mix；
45、所述第二链cdna的合成的反应程序为：16℃，30min→72℃，15min→4℃，恒温孵育。
46、可选地，所述接头连接的反应体系为：58～62μl的da-tailed dna，28～32μl的ligation enhancer，4～6μl的novel t4 dna ligase，4～6μl的dna adapter；
47、所述接头连接的反应程序为：18～22℃，14～16min→3～5℃，恒温孵育。
48、优选地，所述接头连接的反应体系为：60μl的da-tailed dna，30μl的ligati本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(2)中，所述收集mRNA、lncRNA和circRNA采用探针进行。
3.根据权利要求1所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(3)包括：
4.根据权利要求3所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤S2中，所述RNA结合蛋白的编码基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示；
5.根据权利要求3所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤S4中，所述蛋白表达载体的初始表达载体为pT7sp6；
6.根据权利要求1所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(4)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：28～32μL的TNT mix，0.8～1.2μL的RNA结合蛋白表达载体，无酶水补至50μL；
7.根据权利要求1所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(5)中，所述标签蛋白纯化磁珠为Halo标签蛋白纯化磁珠；
8.根据权利要求1所述的
9.根据权利要求1所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(7)中，所述PCR扩增的反应体系包括：24～26μL的2×Super II High-Fidelity Mix，4～6μL的Primer Mix，18～22μL的Adapter Ligated DNA；
10.根据权利要求1所述的一种RNA亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(7)中，所述测序的策略为PE150，测序量为5.8～6.2G。
...【技术特征摘要】
1.一种rna亲和纯化测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种rna亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(2)中，所述收集mrna、lncrna和circrna采用探针进行。
3.根据权利要求1所述的一种rna亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(3)包括：
4.根据权利要求3所述的一种rna亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤s2中，所述rna结合蛋白的编码基因的cds序列如seq id no.1所示；
5.根据权利要求3所述的一种rna亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤s4中，所述蛋白表达载体的初始表达载体为pt7sp6；
6.根据权利要求1所述的一种rna亲和纯化测序方法，其特征在于，步骤(4)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：28～32μl的tnt mix，0.8～1.2μl的rn...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁杉，赵瑞，齐硕，王海鑫，
申请(专利权)人：蓝景科信河北生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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