【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤动物模型，具体涉及一种骨肉瘤pdx模型的构建方法及其应用。
技术介绍
1、病人来源的肿瘤组织（patient derived tumor），来源于患者，肿瘤组织组成多样，异质性完整，具有重要的科研和临床应用价值。随着免疫缺陷小鼠的发展，将病人来源的肿瘤组织接种到免疫缺陷小鼠体内成为可能，为肿瘤药物的开发，免疫治疗的发展以及各种靶向药物的测试提供了非常好的模型。pdx模型（patient-derived xenograft model，pdx）是一种通过将手术切除的病人肿瘤组织接种于免疫缺陷鼠体内而建立的新一代人源肿瘤异种移植模型。这种模型保留了原代肿瘤的组织学、遗传学特征并维持了病人肿瘤的异质性，其药效学结果与临床具有极高的相关性。
2、已有的骨肉瘤pdx模型的构建方法：将患者肿瘤标本使用rpmi 1640培养基（康宁公司，美国纽约）清洗后，切成3~5 mm3的小块，然后用25g穿刺套管针吸入，该套管针用于钝性分离结缔组织，随后通过推动组织套管针，在免疫缺陷小鼠下肢的腹股沟进行皮下组织接种（s.c.）；每周测量一次皮下肿瘤的体积，在达到500 mm3时切除肿瘤以进行传代和冷冻保存。传代方法与骨肉瘤pdx模型构建方法一致，分为组织清洗——切成3~5mm3小块——利用穿刺套管针于腹股沟皮下接种。冷冻保存方法为：首先，将肿瘤样本切成3 mm3的小块，浸泡在适当的保存液中，该保存液的60%为rpmi 1640培养基，30%为胎牛血清（杭州斯基庆生物工程材料有限公司，中国杭州），10%为二甲基亚砜（amere
3、现有的骨肉瘤pdx模型构建方法存在的不足包括：使用套管穿刺针时需要多人配合，并且需要掌握皮下穿刺的技术；对肿瘤样本体积大小和接种数量限制较为严格，因为组织套管穿刺针直径限制，导致过大的肿瘤组织不方便操作；肿瘤冷冻采用传统的程序化冷冻保存，耗费时间长。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术提供一种骨肉瘤pdx模型的构建方法，包括：s1、骨肉瘤患者肿瘤样本预处理，s2、小鼠皮下接种。s1具体地包括：s11、先经过生理盐水对肿瘤样本进行清洗，然后将肿瘤样本放置于0~4℃的低温培养液中存储转运，再通过常温的pbs溶液对肿瘤样本进行清洗，其中，所述培养液包括85%以上的pbs溶液和10%的胎牛血清；s12、采用机械法将肿瘤样本切成2~3mm3的组织块。s2具体地包括：s21、基于患者的肿瘤样本所形成的组织块的数量，对每个患者准备至少2只免疫缺陷小鼠进行pdx模型构建；s22、从每只小鼠的下肢两侧和/或上肢两侧选择接种位点。
2、优选地，所述0~4℃的低温培养液中含有青霉素100-500 u/ml和链霉素100-500ug/ml。
3、优选地，将肿瘤样本放置于0~4℃的低温培养液中存储转运的总时长不超过30分钟。
4、优选地，组织块的形状为方形薄片状。
5、优选地，免疫缺陷小鼠为6~8周龄t、b、nk细胞三重极重度的免疫缺陷小鼠。
6、优选地，每只小鼠最多选择4个接种位点，4个接种位点分别位于小鼠的下肢两侧和上肢两侧。
7、优选地，优先从小鼠的下肢两侧选择接种位点。
8、具体地，当接种位点在上肢侧时，在上腹位置剑突以上0.5㎝利用眼科剪开口，利用镊子通过皮下穿行，对上肢一侧皮下利用镊子进行结缔组织钝性分离，将分割完成的肿瘤组织利用镊子夹取后沿着皮下分离的通道送入相应的接种位点，将镊子停留在位点大约10秒钟时间，待肿瘤组织不再随镊子滑动后，对切口进行缝合处理。当接种位点在下肢侧时，在腹中线距离剑突以下1㎝左右剪开0.5㎝开口，利用镊子钝性分离皮下组织，并用钝头将样本组织块递送至小鼠下肢腹股沟位置，停留大约5秒钟后，取出镊子，将切口行单纯间断缝合法进行缝合。
9、进一步地，还包括：s3、模型传代。具体地包括：s31、待接种的小鼠体内肿瘤体积达到约1000 mm3后，摘取小鼠的肿瘤组织，得到p0原代；s32、将p0原代进行分组，其中一组用于传代，扩大模型的规模。
10、本专利技术还提供一种通过前述方法得到的骨肉瘤pdx模型在筛选预防或治疗骨肉瘤药物中的应用。
11、本专利技术的特点及优点包括：
12、（1）采用上腹和/或下腹部切口，特别适用于多个样本、多个位点接种的情况。相较于现有的组织套管针，患者肿瘤的预处理和动物接种的方式更简单，可实现单人操作。
13、（2）肿瘤标本离体后处理的时间严格限定在30分钟内，可以极大的提高肿瘤组织接种的成功率。
14、（3）通过多位点建立的荷瘤模型，可最大程度利用有限的肿瘤样本和有限的实验动物，快速扩种大批量pdx模型，提高建模效率和建模成本。
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1.一种骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，所述0~4℃的低温培养液中含有青霉素100-500 U/ml和链霉素100-500 ug/ml。
3.根据权利要求2所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，将肿瘤样本放置于0~4℃的低温培养液中存储转运的总时长不超过30分钟。
4.根据权利要求1所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，所述组织块的形状为方形薄片状。
5.根据权利要求4所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，所述免疫缺陷小鼠为6~8周龄T、B、NK细胞三重极重度的免疫缺陷小鼠。
6.根据权利要求5所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，每只小鼠最多选择4个接种位点，4个接种位点分别位于小鼠的下肢两侧和上肢两侧。
7.根据权利要求6所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，优先从小鼠的下肢两侧选择接种位点。
8.根据权利要求6或7所述的骨肉瘤PDX模型的构建方法，其特征在于，
9.根据权利
10.一种如权利要求1～9中任意一项所述方法得到的骨肉瘤PDX模型在筛选预防或治疗骨肉瘤药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种骨肉瘤pdx模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的骨肉瘤pdx模型的构建方法，其特征在于，所述0~4℃的低温培养液中含有青霉素100-500 u/ml和链霉素100-500 ug/ml。
3.根据权利要求2所述的骨肉瘤pdx模型的构建方法，其特征在于，将肿瘤样本放置于0~4℃的低温培养液中存储转运的总时长不超过30分钟。
4.根据权利要求1所述的骨肉瘤pdx模型的构建方法，其特征在于，所述组织块的形状为方形薄片状。
5.根据权利要求4所述的骨肉瘤pdx模型的构建方法，所述免疫缺陷小鼠为6~8周龄t、b、...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋伟杰，王兆松，田建飞，杨吉龙，
申请(专利权)人：天津市肿瘤医院天津医科大学肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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