一种简便的转基因大豆检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学，具体地说是一种简便的转基因大豆检测试剂盒及检测方法。包括包括引物、缓冲液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ聚合酶和对照，其特征在于：包括ＬＡＭＰ反应缓冲液２．５μｌ，内引物ＦＩＰ和ＢＩＰ各２μｌ、外侧引物Ｆ３和Ｂ３各０．３μｌ，甜菜碱１．０μｌ，ＭｇＳＯ↓［４］溶液２．５ｕｌ，荧光染料Ｉ　２．５μｌ；检测为若反应液显示绿色荧光颜色变化，证明所检测的原料中含有转基因大豆。本发明专利技术转基因大豆检测技术特异性强、灵敏度高，而且操作简便，不需要特殊的ＤＮＡ扩增仪。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学，具体的说是一种简便的转基因大豆检测试剂 盒及检测方法。
技术介绍
转基因作物是指利用重组DNA技术将外源基因整合于受体植物基因 组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代，也称为遗传修饰生物体 (Genetically modified organisms, GM0s )。自1983年首例转基因植物问世以来，全球转基因作物的种植面积和销售收入均以倍数增长。但从严 肃的科学意义上说，转基因农产品的生物安全性目前尚无确定的结论。虽 然我国规定自2002年3月20日起，所有转基因农作物及其副产品都应加 以标志，但是在进口转基因大豆数量超出国产大豆的形势下，仍然很少见 到加注转基因字样的农产品。因此开发简便的转基因大豆检测技术并对相 关产品进行检测势在必行。目前普遍应用基于DNA的检测技术对转基因作物进行检测。该类技术 主要包括传统定性PCR和定量PCR。这些检测技术都需要特殊的顧A扩增仪 (PCR仪)才能够完成。而环介导的等温扩增技术(Loop—Mediated 〖sothermal Amplification LAMP)依赖于能够识别耙序列上6个特异区 域的引物和一种具有链置换特性的DM聚合酶，在等温条件下可高效、快 速、高特异地扩增靶序列，因此不需要PCR仪。由此建立基于LAMP扩增技 术的转基因大豆检测方法并开发了相应的检测试剂盒，具有广阔的应用前
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为转基因大豆检测试剂盒包括LAMP反应缓冲液2. 5|il,内引物FIP(浓 度为lOyraol/L)和BIP(浓度为10jumol/L)各2|il、外侧引物F3(浓度为 10pmol/L)和B3(浓度为10jjiiio1/L)各0.3^1、甜菜碱(浓度为 5raol/L) 1. O(il、 dNTPs (浓度为10mmol/L)各2 ju 1 、纯水12. 7^1, MgS04溶 液(浓度为20miiiol/L)2. 5ul; Bs t DNA聚合酶(浓度为8U/uL) 1. O(il,转基因 大豆阳性对照DM溶液(浓度为3|ig/jul) 1^1，荧光染料SYBR GREEN I (100 x电泳用染料)2. 5^1;其中内引物FIP和BIP分别为FIP: CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外侧引物F3和B3分别 为F3: CCTTTAGCA丁TTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。所述每升LAMP检测反应缓冲液中含有20mmol Tris-HCI， lOn腦l KCI, lOmmoi (NH丄SO,， 2mmolMgS04和质量体积比0. 1%的Tri ton X-100。转基因大豆检测方法将待测转基因大豆DNA模板l)il混合在LAMP反 应缓冲液2. 5|il,内引物FIP(浓度为10 ju mol/L)和bip(浓度为10 m mol/L) 各2pl、外侧引物F3(浓度为10nmol/L)和B3(浓度为10 ja raol/L)各0. 3^1、 甜菜碱(浓度为5mol/L)l. O)nl、 dNTPs(浓度为10隱ol/L)各2 ju 1 、纯水 12. 7pl和MgS04溶液(浓度为20mmol/L)2. 5ul中于95-98。C加热5 -lOmin, 然后迅速置于冰浴中，禽心混合后，加入Bst DNA聚合酶(浓度为 8U/uL)l. 0|il在于65。C保温45-60 niin，最后在80-85。C加热10-15min终 止反应，反应物经过电泳检测显示特征性条带，证明所检测的原料中含有 转基因大豆；其中内引物 FIP和BIP分别为 FIP : CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外侧引物F3和B3分别 为F3: CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。将上述经过电泳检测显示特征性条带加入荧光染料SYBR GREEN I ( 100 x电泳用染料)2. 5)il后若反应液显示绿色荧光颜色变化，证明所检测的原 料中含有转基因大豆。所述每升LAMP检测反应缓冲液中含有20mmo1 Tris-HCI， 10n腦l KCI， lOi細ol (肌)2S04, 2mmolMgS04和质量体积比0.1% 的Triton X-100。所述待测转基因大豆DNA模板的提取称取0. 8-1. 2g纯的转基因大豆 粉末，将粉末中加入3.2-4. 8ml预冷4-6t:的提取缓冲液，其中提取缓冲 液每升含有46. 75g N aCI, 50 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8. 0) ， 20 mL 0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0)，混匀'后，再加入4_6ml 60-65。C预热60-65。C的CTAB 提取缓冲液，其中CTAB提取缓冲液每升含有46. 75g NaCI, 20g溴代十六 烷基三甲胺(CTAB) , 50 mL 1 mol/L Tris-HCI (pH 8. 0) ， 20 mL 0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0)，而后在60-65 。C温育30-90min,待冷却后加入3. 6-5. 4ml氯仿、异戊醇、和乙醇的混合液混匀，置于室温放置待分层后，以 10000-13000rpm离心8-10min，上清液中加入4-6ml酚氯仿混合液混勻， 置于室温放置待分层后，以10000-13000rpm离心8-10min取上清液;在上 清液中加入所分离上清夜2/3-1体积的预冷异丙醇混匀，于-28—-2(TC 放置20-30min，在以10000-13000g离心10-20min,所得沉淀即为待测纯 的转基因大豆DNA模板。所述异戊醇、乙醇和氯仿的混合液含量分别为氯 仿75-77%,异戊醇3-5%,乙醇18-22%混合；所述酚氯仿按含量分别为酚 40 - 60 %,氯仿60 - 40 %混合。所得待测转基因大豆DNA模板在体积比 70%-75%乙醇中洗1-2次，待DNA湿度在30-50 %时溶于400-600 n 1含有 RM酶的超纯水中，待用。所述待测转基因大豆謹A提取液为纯的转基因大 豆可将其稀释到l-10-"倍，.稀释后的提取液均可进行检测。所述超纯水为 经过2次蒸馏的双蒸水；j^述超纯水中含0. lmg/mlRNA酶。本专利技术所具有的优点本专利技术设计4条引物对靶序列的6个特异序列 区的识别，保证了 LAMP扩增的高度特异性。即LAMP能从仅相差1个核苷 酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增。并且本专利技术在等温条件下 扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小。同 时耗时短，在lh内可将耙序列扩增至109倍。附图说明图1为本专利技术转基因大豆的LAMP扩增图。(其中A: LAMP扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简便的转基因大豆检测试剂盒，包括引物、缓冲液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ聚合酶和对照，其特征在于：包括ＬＡＭＰ反应缓冲液２．５μｌ，内引物ＦＩＰ和ＢＩＰ各２μｌ、外侧引物Ｆ３和Ｂ３各０．３μｌ，甜菜碱１．０μｌ，ＭｇＳＯ４溶液２．５ｕｌ，荧光染料Ｉ２．５μｌ；其中内引物ＦＩＰ和ＢＩＰ分别为ＦＩＰ：ＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＴＣＡＣ和ＢＩＰ：ＣＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡ；外侧引物Ｆ３和Ｂ３分别为Ｆ３：ＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＧ和Ｂ３：ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＴＡＴＴ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘梅，王雷，陶冉，王宝杰，蒋克勇，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]