【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种抗大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、大口黑鲈是重要的淡水养殖鱼类之一，因其生长迅速、营养高、肉质细嫩鲜美而在世界范围内广泛养殖。大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass virus，lmbv)是从患病大口黑鲈中分离到的病毒性病原，致死率高。lmbv是一种核质型双链dna病毒，隶属于虹彩病毒科蛙病毒属。lmbv感染大口黑鲈引起的典型症状包括烂身、体内外出血和脏器肿大等。近年来，大规模的lmbv感染在大口黑鲈的养殖中时有发生，造成了巨大的经济损失，并威胁大口黑鲈养殖业的健康发展。然而，目前尚未有治疗lmbv感染的有效药物。
2、卵黄抗体(immunoglobulin of yolk，igy)，亦称卵黄免疫球蛋白，是在特异性抗原刺激下由禽类b淋巴细胞产生并转移到卵黄中的多克隆抗体。目前，在水产动物养殖过程中抗生素的滥用不但导致动物产品药物残留，还增加了细菌对抗生素的抵抗力，寻找安全、高效的抗生素替代品迫在眉睫目前，卵黄抗体作为替代抗生素的新型饲料添加剂，正在引起人们的关注。卵黄抗体可从鸡蛋中获取，无需宰杀动物，符合动物权益保护，且具有特异性高、无毒无副作用、对环境友好等特点，而广泛用于诊断和防治动物感染性疾病。
3、目前，科研人员已经做出了部分卵黄抗体在水产动物病毒上的应用研究，比如神经坏死病毒、对虾白斑综合征病毒、鲤疱疹病毒等，但是研究的种类还是较少，尤其是目前没有关于lmbv的报道，因此缺乏针对lmbv的卵黄抗体防治手段。
4、综
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种抗大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中缺乏针对大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)的卵黄抗体防治手段的问题。
2、为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
3、本专利技术公开了一种抗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092卵黄抗体，所述卵黄抗体为利用在大肠杆菌中构建了的大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092亚单位疫苗，并通过纯化注射免疫产蛋鸡，收集所述免疫蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。
4、具体的，所述卵黄抗体的制备步骤为：
5、(1)制备抗原：在大肠杆菌中构建大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092亚单位疫苗，并诱导表达纯化蛋白vp092，收获纯化后的重组蛋白vp092；
6、(2)免疫蛋鸡：将纯化后的重组蛋白vp092首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；
7、(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。
8、步骤(1)中，抗原的制备具体为：以大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)的蛋白vp092作为目标抗原蛋白，将蛋白vp092基因开放阅读框插入到载体pet-32α中，转化原核表达菌株bl21，构建重组表达蛋白vp092的工程菌；重组菌经过37℃温度诱导、洗涤、纯化溶解、复性和透析后纯度达到90％以上，收获纯化后的重组蛋白vp092，即得抗原。
9、步骤(2)中，免疫蛋鸡具体为：将重组蛋白vp092对蛋鸡进行三次免疫，每次选择胸肌下注射1ml，每次免疫间隔一周。第三次免疫后的一周开始收集鸡蛋。
10、步骤(3)中，卵黄抗体的分离具体为：在收集鸡蛋的卵黄液中加入9倍体积的去离子水稀释，调节ph至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清,得到卵黄抗体粗提物。
11、步骤(3)中，卵黄抗体的纯化具体为：向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终饱和度为50％，搅拌均匀后，4℃下离心，加入pbs溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液至饱和度为33％，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量pbs溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092卵黄抗体。
12、另一方面，本专利技术还提供上述的抗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092卵黄抗体在制备检测大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
13、另一方面，本专利技术还提供上述的抗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092卵黄抗体在制备预防和/或治疗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)引起疾病方面的药物或饲料添加剂中的应用。
14、另一方面，本专利技术还提供一种检测大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)的检测试剂或检测试剂盒，包含上述的抗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)蛋白vp092卵黄抗体。
15、另一方面，本专利技术还提供一种抗大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体效价检测方法，采用间接酶联免疫吸附试验(elisa)检测抗大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的效价，具体步骤如下：以10μg/ml lmbv蛋白vp092包被酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜，pbst洗涤3次后，加入含5％bsa的封闭液，37℃封闭2h。洗涤3次后加入倍比稀释的抗大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体，同时设置空白对照和阴性对照组，37℃孵育2h。洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡二抗，37℃孵育1h。洗涤4次后，加入tmb显色液，37℃避光显色15-30min。然后，加2mh2so4终止液100μl，进行终止反应。最后，用酶标仪读取450nm的od值。待测样品与阴性对照吸光值比值大于2.1判定为阳性，最大阳性稀释度为抗体效价。
16、本专利技术具有以下有益效果：
17、(1)本专利技术的抗大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)卵黄抗体蛋白vp092可从鸡蛋中获取，无需宰杀动物，符合动物权益保护，且具有特异性高、无毒无副作用、对环境友好，可用于防治大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)引起的疾病。
18、(2)本专利技术的抗大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体由于禽类与哺乳类动物存在种系发生学距离，两者的免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应，且在水产动物养殖过程中抗生素的滥用不但导致动物产品药物残留，还增加了细菌对抗生素的抵抗力，卵黄抗体可作为替代抗生素的新型饲料添加剂。
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1.一种抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV蛋白VP092卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，抗原的制备具体为：以大口黑鲈虹彩病毒LMBV的蛋白VP092作为目标抗原蛋白，将蛋白VP092基因开放阅读框插入到载体pET-32α中，转化原核表达菌株BL21，构建重组表达蛋白VP092的工程菌；重组菌经过37℃温度诱导、洗涤、纯化溶解、复性和透析后纯度达到90％以上，收获纯化后的重组蛋白VP092，即得抗原。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，免疫蛋鸡具体为：将重组蛋白VP092对蛋鸡进行三次免疫，每次选择胸肌下注射1mL，每次免疫间隔一周。第三次免疫后的一周开始收集鸡蛋。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，卵黄抗体的分离具体为：在收集鸡蛋的卵黄液中加入9倍体积的去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清,得到卵黄抗体粗提物。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，卵黄
6.一种抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV蛋白VP092卵黄抗体，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到。
7.权利要求6所述的抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV蛋白VP092卵黄抗体在制备检测大口黑鲈虹彩病毒LMBV的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
8.权利要求6所述的抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV蛋白VP092卵黄抗体在制备预防和/或治疗大口黑鲈虹彩病毒LMBV引起疾病方面的药物或饲料添加剂中的应用。
9.一种检测大口黑鲈虹彩病毒LMBV的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的抗大口黑鲈虹彩病毒LMBV蛋白VP092卵黄抗体。
...【技术特征摘要】
1.一种抗大口黑鲈虹彩病毒lmbv蛋白vp092卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，抗原的制备具体为：以大口黑鲈虹彩病毒lmbv的蛋白vp092作为目标抗原蛋白，将蛋白vp092基因开放阅读框插入到载体pet-32α中，转化原核表达菌株bl21，构建重组表达蛋白vp092的工程菌；重组菌经过37℃温度诱导、洗涤、纯化溶解、复性和透析后纯度达到90％以上，收获纯化后的重组蛋白vp092，即得抗原。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，免疫蛋鸡具体为：将重组蛋白vp092对蛋鸡进行三次免疫，每次选择胸肌下注射1ml，每次免疫间隔一周。第三次免疫后的一周开始收集鸡蛋。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，卵黄抗体的分离具体为：在收集鸡蛋的卵黄液中加入9倍体积的去离子水稀释，调节ph至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清,得到卵黄抗体粗提物。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：周胜，刘士佳，罗佳怡，王权，梁霞，秦启伟，宁运尚，梁增健，
申请(专利权)人：广州南沙华农渔业研究院，
类型：发明
国别省市：
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