一种CRISPR核酸检测方法技术

本发明专利技术涉及核酸检测技术领域，尤其涉及一种CRISPR核酸检测方法，该方法通过在扩增反应过程中混入CRISPR反应体系，可在保证较高检测灵敏度的同时，使扩增和检测反应同时进行，进一步降低检测时间，经验证，利用该方法进行CRISPR高敏核酸检测，在保证低浓度待测物检测灵敏度的同时，时间可缩短至12min，且该方法具有良好的特异性，RPA扩增后CRISPR再次起到识别靶标的作用，避免了单独RPA反应的可能出现的假阳性结果，该方法在两步法检测的基础上，保持了检测的灵敏度的同时，缩短了检测时间，可达单分子检测水平，满足临床检测的需求。解决现有技术中的两步法检测基于CRISPR的核酸检测时间长，无法实现快速检测与灵敏度兼容的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸检测，具体为一种crispr核酸检测方法，尤其是一种crispr核酸高敏快速检测方法。

技术介绍

1、由细菌、真菌、病毒等病原微生物引起的各类感染性疾病及突发传染病仍然是对人类健康和全球公共卫生安全的重大威胁。灵敏、特异、快速的诊断检测不仅为感染性疾病的有效治疗铺平了道路，而且对预防传染病的传播起着至关重要的作用。常见的核酸检测方法有荧光定量pcr法、恒温扩增法(如rpa、lamp等)、数字pcr法和二代测序等。

2、近年来，crispr/cas系统除具有基因编辑功能外，在核酸检测方面具有巨大优势。如cas12a在crispr rna(crrna)的引导下，可以在反应1h后能直接检测皮摩尔(pm)水平的dsdna。cas13a可以在1～3h内检测到～50飞摩尔(fm)的靶rna。然而，在许多实际情况下，如临床诊断，需要较高的检测灵敏度(约在am)。研究人员将其与等温扩增技术联用，有效弥补了基于crispr核酸检测灵敏度低、等温扩增特异性不足的问题，并降低了设备依赖性、简化了操作难度。这其中rt-rpa由于其反应温度范围和常用的本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种CRISPR核酸检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的CRISPR核酸检测方法，其特征在于，在进行扩增反应前，对RPA反应体系和CRISPR反应体系进行优化，包括：

3.根据权利要求2所述的CRISPR核酸检测方法，其特征在于，筛选最佳RPA引物对的方法为：

4.根据权利要求3所述的CRISPR核酸检测方法，其特征在于，所述Tris饱和DNA抽提液包括体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇。

5.根据权利要求2所述的CRISPR核酸检测方法，其特征在于，根据最佳RPA引物对应的扩增区域，选择最佳crRNA序列的方法...

【技术特征摘要】

1.一种crispr核酸检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的crispr核酸检测方法，其特征在于，在进行扩增反应前，对rpa反应体系和crispr反应体系进行优化，包括：

3.根据权利要求2所述的crispr核酸检测方法，其特征在于，筛选最佳rpa引物对的方法为：

4.根据权利要求3所述的crispr核酸检测方法，其特征在于，所述tris饱和dna抽提液包括体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇。

5.根据权利要求2所述的crispr核酸检测方法，其特征在于，根据最佳rpa引物对应的扩增区域，选择最佳crrna序列的方法为：根据最佳rpa引物对应的扩增区域，在rpa扩增后进行crispr剪切，阳性的荧光值出现最早，阴性无荧光的即为最佳crrna序列。

6.根据权利要求1所述的crispr核酸检测方法，其特征在于，每10μl的crispr反应体系包括：50～200nm的lbcas1...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡飞，张云云，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：