【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用。
技术介绍
1、fat2(fat atypical cadherin 2，非典型钙粘蛋白2)是钙粘蛋白细胞粘附分子超家族的成员，在多种肿瘤细胞细胞膜上表达。fat2在95％的肺鳞癌中表达，且在头颈癌、食管癌、宫颈癌和子宫内膜癌等多种癌症中高表达(图1)。因此，fat2是实体瘤治疗的理想靶点。
2、il-15sa融合蛋白可以延长il-15在血清中的半衰期，增强il-15β受体对免疫细胞的亲和力；募集cd8+ t细胞、cd4+ t细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞；特异性结合il-15并与周围效应nk细胞和t细胞上的il-15rβ-γ链形成免疫突触结构，激活nk和t细胞的jak/stat等通路发挥作用，促进cd3+ t细胞(主要是cd8+ t细胞)和nk1.1+细胞增殖；促进体内细胞因子对t细胞参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用；il-15还可以诱导寿命更长、亲和力更高的cd8+ t细胞，有效地杀死肿瘤细胞，最终增强免疫疗法的抗肿瘤作用。
3、il-36γ是il-1rl2/il-36r通路释放的细胞因子，可以激活靶细胞中的nf-κb和mapk信号通路。研究表明il-36γ存在于上皮屏障中并参与局部炎症反应：直接作用于角质形成细胞、树突状细胞和间接作用于t细胞来驱动组织浸润、细胞成熟和细胞增殖，从而参与皮肤炎症反应。il-36γ可以诱导巨噬细胞、t细胞和中性粒细胞趋化因子的表达，例如ccl3、ccl4、ccl5、
4、cxcl11(c-x-c motif chemokine ligand 11)属于cxc趋化因子家族，在外周血白细胞、胰腺和肝脏高度表达，在胸腺、脾和肺中等程度表达，在小肠、胎盘和前列腺组织低表达。cxcl11与靶细胞趋化因子受体cxcr3相互作用，可以趋化活化的t细胞至肿瘤组织。
5、ccr8(c-c motif chemokine receptor 8)是趋化因子受体亚家族的成员之一，属于g蛋白偶联受体。人ccl1是ccr8的主要配体，其它配体有ccl8、ccl16和ccl18。ccr8在肿瘤浸润的调节性t细胞(treg)上特异性表达，在th2和肿瘤细胞也均有表达；然而在外周血treg或正常组织上基本不表达。ccr8的主要作用是参与treg和th2向炎症和肿瘤部位的募集。大量研究发现，高表达的ccr8与多种癌症相关，包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌、转移性脑癌、转移性肝癌，尤其是在乳腺癌treg中高表达。ccl1结合cd4+ t细胞上的ccr8，导致cd4+ t细胞转化为treg。ccl1结合treg细胞上的ccr8，treg细胞向炎症或肿瘤部位募集。ccr8/ccl1轴不仅将ccr8+ treg细胞招募到tme中，还可诱导对treg细胞免疫抑制功能至关重要的foxp3、cd39和il-10上调。研究发现，与正常组织中的treg细胞相比，ccr8在人乳腺癌的肿瘤浸润性treg细胞中显著上调，暗示ccr8是tme中treg上的治疗靶点，而不会引起系统性自身免疫疾病。
6、cxcr6(c-x-c motif chemokine receptor 6)和其独有的配体趋化因子16(ccl16)促进细胞-细胞迁移，可调节t淋巴细胞迁移到各种外周组织(肝、脾红髓、肠、肺和皮肤)。cxcr6/ccl16还调控常驻记忆t淋巴细胞在肺不同区域的定位，并维持呼吸道常驻记忆t淋巴细胞的功能。
7、细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达car后，将其回输至人体。表达car的免疫细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用。通过将本专利技术的融合嵌合抗原受体表达于t细胞中，得到car-t细胞，能够有效并且特异性地靶向表达fat2表面抗原的肿瘤细胞，还可分泌il-15sa、il-36γ或cxcl11，同时膜表达ccr8或cxcr6，增强t细胞、nk细胞、树突状细胞、巨噬细胞和粒细胞等免疫细胞的招募，促进car-t细胞浸润癌组织。
2、本专利技术涉及一种靶向表达fat2表面抗原细胞的嵌合抗原受体修饰的t细胞。
3、本专利技术涉及一种靶向表达fat2表面抗原细胞的招募嵌合抗原受体修饰的t细胞，可同时分泌il-15sa、il-36γ或cxcl11，增强t细胞、nk细胞、树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞等免疫细胞的招募。
4、本专利技术涉及一种靶向表达fat2表面抗原细胞的浸润嵌合抗原受体修饰的t细胞，同时表达ccr8或cxcr6，可以促进car-t细胞浸润癌组织。
5、本专利技术涉及一种靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体修饰的t细胞，可分泌il-15sa、il-36γ或cxcl11，同时表达ccr8或cxcr6，增强t细胞、nk细胞、树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞等免疫细胞的招募，并促进car-t细胞浸润癌组织。
6、本专利技术的的目的通过下述技术方案实现：
7、本专利技术提供一种靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，为以下至少一种：
8、(1)靶向表达fat2表面抗原细胞的嵌合抗原受体；
9、(2)靶向表达fat2表面抗原细胞，同时分泌il-15sa、il-36γ或cxcl11的招募嵌合抗原受体；
10、(3)靶向表达fat2表面抗原细胞，同时膜表达ccr8或cxcr6的浸润嵌合抗原受体；
11、(4)靶向表达fat2表面抗原细胞，且分泌il-15sa、il-36γ或cxcl11，同时膜表达ccr8或cxcr6的融合嵌合抗原受体。
12、作为本专利技术的进一步改进，所述融合嵌合抗原受体包含cd8α信号肽结构域、fat2结合结构域、标签蛋白、连接域、跨膜结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于，为以下至少一种：
2.根据权利要求1所述靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述融合嵌合抗原受体包含CD8α信号肽结构域、FAT2结合结构域、标签蛋白、连接域、跨膜结构域、细胞内信号结构域、分泌IL-15SA的招募结构域、IL-36γ的招募结构域或CXCL11的招募结构域、膜表达CCR8的浸润结构域或CXCR6的浸润结构域。
3.根据权利要求2所述靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述FAT2结合结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQID NO:15中的至少一种；CD8α信号肽结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO:27；所述标签蛋白为Strep II结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述连接域为CD8铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；所述跨膜结构域为CD28 TM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；所述细胞内信号结构域由CD28
4.根据权利要求2所靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述分泌IL-15SA的招募结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述分泌IL-36γ的招募结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述分泌CXCL11的招募结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
5.根据权利要求2所述靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述膜表达CCR8的浸润结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述膜表达CXCR6浸润结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
6.根据权利要求2所述靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述IL-15SA的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述IL-36γ的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述CXCL11的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述CCR8的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示；所述CXCR6的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
7.一种表达权利要求1-6任一项所述的靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体的重组表达载体或宿主细胞，其特征在于：包含所述的嵌合抗原受体、招募嵌合抗原受体、浸润嵌合抗原受体、融合嵌合抗原受体中至少一种的表达框；所述嵌合抗原受体、招募嵌合抗原受体、浸润嵌合抗原受体、融合嵌合抗原受体的表达框由在T细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体、招募嵌合抗原受体、浸润嵌合抗原受体、融合嵌合抗原受体的核苷酸组成。
8.根据权利要求7所述的重组表达载体或宿主细胞，其特征在于：所述重组表达载体通过将编码所述融合嵌合抗原受体的核苷酸插入慢病毒表达载体中的EF-1α启动子的3’下游得到。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体修饰的T细胞。
10.一种如权利要求9所述的靶向表达FAT2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用，其特征在于：所述实体肿瘤为FAT2特异高表达肿瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于，为以下至少一种：
2.根据权利要求1所述靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述融合嵌合抗原受体包含cd8α信号肽结构域、fat2结合结构域、标签蛋白、连接域、跨膜结构域、细胞内信号结构域、分泌il-15sa的招募结构域、il-36γ的招募结构域或cxcl11的招募结构域、膜表达ccr8的浸润结构域或cxcr6的浸润结构域。
3.根据权利要求2所述靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述fat2结合结构域的氨基酸序列包括seq id no:1、seq id no:11、seq id no:13和seqid no:15中的至少一种；cd8α信号肽结构域的氨基酸序列包括seq id no:27；所述标签蛋白为strep ii结构域，其氨基酸序列如seq id no:3所示；所述连接域为cd8铰链区，其氨基酸序列如seq id no:23所示；所述跨膜结构域为cd28 tm，其氨基酸序列如seq id no:25所示；所述细胞内信号结构域由cd28 icd、4-1bb icd和cd3ζ组成，其氨基酸序列如seq idno:5所示。
4.根据权利要求2所靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，其特征在于：所述分泌il-15sa的招募结构域的氨基酸序列如seq id no:7所示；所述分泌il-36γ的招募结构域的氨基酸序列如seq id no:17所示；所述分泌cxcl11的招募结构域的氨基酸序列如seq id no:19所示。
5.根据权利要求2所述靶向表达fat2表面抗原细胞的融合嵌合...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙钒，吕梦清，崔烨挺，熊铭瑞，肖迪，孙翰祥，陈晨，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：
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