【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种rna在的设计及制备方法，更具体一点说，涉及一种环状rna在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法，属于生物基因工程领域。
技术介绍
1、环状rna是一种不暴露末端碱基且完全闭环的rna分子与线性rna相比，环状rna分子具有更高的稳定性和细胞内半衰期，无论在rna疫苗领域和rnai药物领域都具有巨大的应用潜力。目前环状rna多以体外方式合成，存在大规模生产纯化成本高，操作繁琐，且较易引发免疫原性等诸多问题从而限制了环状rna的大规模应用，因此体内合成环状rna的策略得到了广泛关注。
2、目前，体内合成环状rna方法是将核酶作为环化元件，以细胞和大肠杆菌为载体，通过体内转录的方式大量表达目的环状rna，该方法仅需简单的rna提取及纯化步骤即可实现环状rna富集。与体外合成相比，体内合成环状rna具有操作简便、生产纯化成本低、可大规模生产等优点。目前常用的体内合成方法一般是使用i型内含子或alu序列作为环化元件，这些元件只能对特定环状rna进行环化，无法实现对任意环状rna序列的环化，同时还会引入一小段非预期序...
【技术保护点】
1.一种环状RNA在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法,其特征在于，所述环状RNA包括四种目的片段：c1700、c1400、c500、c64，其中，c1700的片段为随机序列；c1400的片段被设计用于荧光检测，首先将IRES序列分为两段，反向拼接于GFP序列两端，生成一个ES-GFP-IR的序列；c500的片段是从IRES序列中选取；c64的环状序列是由一个23bp的双链和两端各9bp的茎环组成。
2.根据权利要求1所述的一种环状RNA在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种环状R...
【技术特征摘要】
1.一种环状rna在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法,其特征在于，所述环状rna包括四种目的片段：c1700、c1400、c500、c64，其中，c1700的片段为随机序列；c1400的片段被设计用于荧光检测，首先将ires序列分为两段，反向拼接于gfp序列两端，生成一个es-gfp-ir的序列；c500的片段是从ires序列中选取；c64的环状序列是由一个23bp的双链和两端各9bp的茎环组成。
2.根据权利要求1所述的一种环状rna在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种环状rna在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法,其特征在于：将目的rna粗提物经licl纯化后，能够通过rnase r、rt-pcr、荧光表达检测实现检测目的rna是否环化。
4.根据权利要求2或3所述的一种环状rna在大肠杆菌体内精确合成的设计及制备方法,其特征在于：步骤4)具体为：将四种重组质粒转化进入大肠杆菌ht115(de3)，并将转入了pet-28a原始质粒的菌作为对照组，在含0.1mg/ml硫酸卡那霉素的液体lb培养基中...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵夏阳，吕崇润，金伟波，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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