腹泻性贝毒软海绵酸ＯＡ金标测试板条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种腹泻性贝毒软海绵酸ＯＡ金标测试板条及其制备方法，提供了一种赤潮毒素腹泻性贝毒软海绵酸的快速胶体金免疫层析检测方法。本发明专利技术通过制备平均粒径３０ｎｍ的胶体金，用以标记抗软海绵酸单克隆抗体；将软海绵酸半抗原与卵清蛋白的偶联物包被在硝酸纤维素膜上作为检测带，羊抗鼠二抗作为质控带，依据免疫竞争法原理，制备了快速检测腹泻性贝毒软海绵酸ＯＡ金标测试板条。本发明专利技术通过对胶体金的制备，胶体金的标记等等，多个条件的优化，大大提高了ＯＡ金标测试板条的检测速度。该方法灵敏度达２５ｎｇ／ｍＬ，只需３－５ｍｉｎ即可目测判断结果，可作为检验水产品贝类是否感染赤潮毒素并进行现场大量筛选的有效手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫测定方法，更具体地，涉及一种应用金标技术进行免疫学检测的方法。
技术介绍
近20年来，有害赤潮在全球范围内频繁爆发，其中有毒赤潮和藻毒素问题日渐突 出。赤潮藻毒素通过食物链传递，在鱼、贝类体内累积，会造成严重的海产品食用安全问 题。由这类海洋生物毒素引起食源性中毒事件已经引起了各国的关注，因此国内外纷纷对 各种毒素进行了多方面的研究，包括结构和功能、毒素生源和检测方法的研究等。腹泻性 贝毒(diarrheticshellfish poisoning, DSP)是由有毒赤潮藻类鳍藻属Di,hysis禾口 原甲藻属Prorocentrum中部分藻种产生的一类脂溶性天然化合物，主要成分为软海绵酸 (okadaic acid，0A)及其衍生物DTXs。 DSP引起的中毒症状包括腹泻(92% )、恶心(80% )、 呕吐(79%)、下腹部疼痛(53X)，一般在食用后几小时，严重时短至30min发作，且无有效 药物治疗。 由于0A对热稳定， 一般的加热处理不会使毒性失效，因此由OA引起的海产品食物 中毒事件已成为国内外卫生学上严重的问题之一。目前，国内检测0A的方法主要是小鼠 法、高效液相色谱法(HPLC)和免疫检测技术。小鼠法简便易行，但缺点是不能区别毒素的 种类和结构，受干扰较大，数据不精确；HPLC法可准确分析毒素的含量和种类，检测限可低 至ng/g，但样品前处理过程复杂，且仪器昂贵，需要专门的分析技术人员。免疫层析法是出 现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式，由于它的快速简便、准确，具有高度 特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，无需贵重仪器设备，简化了 烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，因此已成为一种目前发展最快的 复合型免疫技术，受到国内外研究人员的广泛关注。 免疫层析法(immunochromatography)是胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应 用，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一 端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定 有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫 酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 专利CN101131390A描述了一种快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条及其制 法，检测下限达到12. 5ng/ml，检测速度达到15min。现场检测的即时性需要更短的检测时 间。影响免疫层析法诊断结果的因素很多，包括胶体金的制备，胶体金的标记等等，本专利技术 通过对多个条件的优化，在不降低检测灵敏度的同时，大大提高了检测速度。
技术实现思路
本专利技术通过对0A金标测试板条及其制备方法中各个条件的优化，使OA金标测试 条的检测速度大大提高。技术方案如下 —种腹泻性贝毒软海绵酸OA金标测试板条，包括胶金垫，检测线，控制线，所述的 胶金垫包被有金标记的软海绵酸OA单克隆抗体，所述的控制线为羊抗鼠多克隆抗体，包被 浓度为0. 4-1. 8mg/ml，包被量为0. 5ul/cm。 所述的金标记的软海绵酸OA单克隆抗体使用30nm的胶金体进行金标记，金标记 的单克隆抗体浓度优选为200ug/ml。 所述的胶金垫的OA单克隆抗体包被量优选为2. 5 ii l/cm。 所述的检测线包被有软海绵酸-卵白蛋白偶联物，包被浓度优选为0. 75mg/ml，包 被量优选为0. 5ul/cm。 所述的控制线包被有羊抗鼠多克隆抗体，包被浓度优选1. Omg/ml，包被量优选为 0. 5ul/cm。 —种权利要求1所述的腹泻性贝毒软海绵酸OA金标测试板条制备方法，包括如下 步骤 (1)单克隆抗体的制备用软海绵酸_牛血清蛋白偶联物免疫BALB/c小鼠，取效 价达到l : 1.28乂106以上的免疫小鼠腹水用作软海绵酸单克隆抗体； (2)金标胶金体的制备制备30nm的胶金体用于金标记软海绵酸单克隆抗体，金 标时软海绵酸单克隆抗体浓度优选为200ug/ml ; (3)检测线包被抗原及浓度确定用碳二亚胺法制备包被抗原软海绵酸_卵白蛋 白偶联物，包被浓度优选用0. 75mg/ml，包被量优选用0. 5ul/cm ; (4)控制线的制备用羊抗鼠多克隆抗体包被，包被浓度为0. 4-1. 8mg/ml，包被量 优选为0. 5ul/cm。 本专利技术工作原理是待检样品溶液加在试纸条的一端，通过毛细作用向上移行，样 品中的OA先与金标记的anti-OA-IgG发生特异性免疫反应；反应后，免疫复合物继续上移 至测试区(喷有OA-OVA，测试带检测线T)，如果样品中的OA足够多，全部结合了金标抗体 的位点，则免疫复合物在测试区不停留，测试条带不显色；随后，免疫复合物继续移动至对 照区(喷有羊抗鼠的第二抗体，对照带控制线C)，发生第二种免疫结合反应，免疫复合物被 截留，对照带显红色。当样品中不含OA或OA的量低于检出限时，两条带均显红色，根据测 试带颜色的深浅可判断样品中待测物OA的多少。 影响金标测试条灵敏度及快速检测的因素很多，包括金标及金标单抗的制备，金 标单抗的包被，检测线T上抗体偶联物的包被，控制线C上多抗的包被条件等等。本专利技术通 过摸索不同用量的柠檬酸三钠与氯金酸反应，不同的金标单抗浓度，不同的金标单抗包被 量，不同的抗原偶联物包被浓度，不同的二抗包被浓度以及不同的反应时间来研究比较胶 体金层析方法的效果，由此制备的金标测试条灵敏度达到25ng/ml，只需3-5min即可目测 判断结果，大大提高了检测效率。 对比文件声明测试灵敏度达到12. 5ng/ml，是由于其将弱阳性视为检出，而本专利技术 将弱阳性视为未检出，从而造成灵敏度表述上的差异。根据有关OA等DSP毒素的食用标准， 各国所建议食用标准的安全浓度不同，美国食品和药品管理局(FDA)规定水产品可食部分 为0. 2mg/L ;日本规定扇贝中肠腺OA为2. 5 ii g/g，紫贻贝中肠腺1. 5 y g/g ;澳大利亚规定 100g可食部分OA含量低于25 ii g， lg中肠腺OA含量低于2 y g ;欧洲规定lg可食部分允许 含0. 2-0. 6 ii gOA等价物；加拿大、英国等为20 ii g/100g软组织；荷兰定为0. 12-0. 14 y g/g消化腺；我国贝类产品出口卫生要求DSP毒素含量小于0. 8mg/L(80 y g/100g)。因此，本发 明建立的OA检测方法的检出限，完全能满足海产贝类食品安全检测的需要。附图说明 图1 :腹泻性贝毒软海绵酸OA金标测试板条制备工艺流程图 图2 :胶体金层析试纸条检测结果具体实施例方式下面根据具体实施例对本专利技术进行进一步说明，所述方法若未说明均属常规方 法，如记载于J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著的《分子克隆实验指南》或教科书。 —、试剂与仪器 软海绵酸(OA)标准品(购自台湾藻类生物技术有限公司)；1.0mg/ml羊抗 鼠HRP-IgG(购自上海鼎国生物技术有限公司)；卵白蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)、 新生牛血清、N-羟丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 、 N， N双环乙烷碳二亚胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腹泻性贝毒软海绵酸ＯＡ金标测试板条，包括胶金垫，检测线，控制线，所述的胶金垫包被有金标记的软海绵酸ＯＡ单克隆抗体，其特征在于，所述的控制线为羊抗鼠多克隆抗体，包被浓度为０．４－１．８ｍｇ／ｍｌ，包被量为０．５ｕｌ／ｃｍ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何培民，柳俊秀，蔡春尔，汪卿，饶涛，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]