【技术实现步骤摘要】
本公开涉及细胞分离，尤其涉及一种单细胞制动分离方法及其在单细胞生物工程中的应用。
技术介绍
1、单细胞分离技术是一种将复杂的生物样本中的某种类型或者某个细胞分离出来的技术，广泛应用于癌症研究、免疫学研究、遗传学研究以及干细胞研究等领域。
2、常用的单细胞制动分离方法有显微操作法，连续稀释法，荧光流式分选法，激光捕获显微切割技术以及微流控技术等。显微操作法是常用的单细胞制动分离方法之一，尤其适用于细胞量极少(＜50个)的情况。
3、目前的显微操作法缺乏标准的操作流程，方法步骤不统一，有的采用断针法转移，有的采用移液枪转移，这些方法均存在转移成功率低、丢失率高等缺点，转移成功率仅20-50％，严重影响实验效率和实验结果的稳定。
4、因此，建立一种高效统一的单细胞制动分离方法是解决上述问题的关键。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本申请提出一种单细胞制动分离方法及其在单细胞生物工程中的应用。
2、本申请一方面，提出一种单细胞制动分离方法，包括如下步骤：
3、s1、单个精子分选并进行制动处理；
4、s2、将制动后的单个精子洗涤并转移；
5、s3、对转移后的洗涤液进行检测，判断单个精子是否转移成功。
6、作为本申请的一可选实施方案，可选地，s1、单个精子分选并进行制动处理，包括：
7、s10、制备精液沉淀：
8、预备缓冲液；
9、取精并预处理，得到精液原液，
10、加入缓冲液至所述离心管中，混合均匀后，经过离心、去除上清液之后，得到精液沉淀；
11、s11、制作培养皿：
12、在培养皿中分别做如下标记：
13、数字标记：其标记处放置1μl的g-mops微量液滴；
14、mops圈标记：其圈内放置5μl的g-mops液滴；
15、pvp圈标记：其圈内放置5μl的pvp液滴；
16、标记完毕，覆盖一层矿物油至培养皿表面；
17、s12、单个精子分选制动：
18、配置icsi显微操作针和显微操作系统；
19、将步骤s10中的所述精液沉淀转移至步骤s11中培养皿的所述mops圈中，并将所述培养皿置于所述显微操作系统的载物台上，并调整好放大倍数；
20、操作所述icsi显微操作针并移动至所述mops圈中，选择一条精子吸入并转移至所述pvp圈中；
21、在所述pvp圈的pvp滴液中，调整所述icsi显微操作针至该精子尾部前端的三分之一处，落针，损伤其尾部，将精子制动，得到制动后的单个精子。
22、作为本申请的一可选实施方案，可选地，步骤s10中，所述缓冲液为5ml的g-mops缓冲液，并在37℃培养箱内平衡培养至少6h。
23、作为本申请的一可选实施方案，可选地，步骤s10中，所述培养皿中的数字标记，等间距设置有5个。
24、作为本申请的一可选实施方案，可选地，所述icsi显微操作针末端孔径5μm。
25、作为本申请的一可选实施方案，可选地，步骤s12中，在操作所述icsi显微操作针并移动至所述mops圈中，选择一条精子吸入并转移至所述pvp圈中之前，还包括：
26、预先在所述icsi显微操作针中吸取预设量的pvp液滴。
27、作为本申请的一可选实施方案，可选地，s2、将制动后的单个精子洗涤并转移，包括：
28、s20、预先准备一ep管和一新的转移皿，其中：所述ep管中预先置入裂解液或培养液，并在离心机800g离心1分钟，确保裂解液/培养液在管底；所述新的转移皿中放置有两滴20μl g-mops液滴；
29、s21、吸取制动后的单个精子，并转移至一数字标记的1μl g-mops微量液滴中；
30、s22、在显微操作系统之下，将所述剥卵针置入含有精子的数字标记的1μl g-mops微量液滴边沿，从边沿将液滴全部吸入剥卵针；
31、s23、依次采用所述新的转移皿中的两滴20μl g-mops液滴，洗去所述剥卵针表面的矿物油，并将所述剥卵针中的液体转移至预先准备好的ep管中。
32、作为本申请的一可选实施方案，可选地，s3、对转移后的洗涤液进行检测，判断单个精子是否转移成功，包括：
33、将步骤s21中已转移单个精子的1μl g-mops微量液滴和步骤s23中洗涤后的两滴20μl g-mops液滴，分别置于显微镜下观察，判断所述1μlg-mops微量液滴和所述两滴20μlg-mops液滴中是否含有精子：
34、若不含有，则表明转移成功；
35、反之放弃转移。
36、本申请另一方面，提出一种单细胞制动分离方法在单细胞生物工程中的应用，该方法应用于：
37、单细胞测序、单细胞基因编辑、单细胞力谱，细胞系构建、遗传性疾病单体型构建或者单个精子冷冻。
38、本专利技术的技术效果：
39、本申请通过采用四种核心技术确保单个精子转移至特定容器。1、精子制动：采用显微操作针，破坏精子尾部的细胞膜，使精子丧失活动力。2、使用显微操作针，将制动后的精子转移至1μl的微量液滴。3、使用剥卵针，将含有单个精子的微量液滴全部转移至特定容器。4、显微镜下复核，观察精子是否被转移。前期实验显示精子的转移成功率达到97.9％，彻底解决单个精子分选和转移丢失率高的瓶颈问题。
40、根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本公开的其它特征及方面将变得清楚。
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1.一种单细胞制动分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，S1、单个精子分选并进行制动处理，包括：
3.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，步骤S10中，所述缓冲液为5mL的G-MOPS缓冲液，并在37℃培养箱内平衡培养至少6h。
4.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，步骤S10中，所述培养皿中的数字标记，等间距设置有5个。
5.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，所述ICSI显微操作针末端孔径5μm。
6.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，步骤S12中，在操作所述ICSI显微操作针并移动至所述MOPS圈中，选择一条精子吸入并转移至所述PVP圈中之前，还包括：
7.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，S2、将制动后的单个精子洗涤并转移，包括：
8.根据权利要求7所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，S3、对转移后的洗涤液进行检测，判断
9.一种权利要求1-8中任一项所述单细胞制动分离方法在单细胞生物工程中的应用，其特征在于，包括：该方法应用于：
...【技术特征摘要】
1.一种单细胞制动分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，s1、单个精子分选并进行制动处理，包括：
3.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，步骤s10中，所述缓冲液为5ml的g-mops缓冲液，并在37℃培养箱内平衡培养至少6h。
4.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，步骤s10中，所述培养皿中的数字标记，等间距设置有5个。
5.根据权利要求2所述的一种单细胞制动分离方法，其特征在于，所述icsi显微操作针末端孔径5μm。...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋凌英，张副兴，姚绿，孔菲菲，童晓嵋，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属邵逸夫医院，
类型：发明
国别省市：
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